3.5 ความสามารถในการจับโลหะ (Metal chelating activity)
ค่าความสามารถในการจับโลหะของชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ ครอบคลุม 4 จังหวัด ได้แก่ จังหวัดแพร่ จังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และ จังหวัดน่านแสดงดังภาพที่ 46 ค่าความสามารถในการจับโลหะของชาเมี่ยงของจังหวัดเชียงใหม่สูงกว่าจังหวัดน่าน จังหวัดลำปาง และจังหวัดแพร่ ซึ่งมีค่าความสามารถในการจับโลหะเท่ากับ 1,127.25 1,157.35 1,356.12 และ 1,198.65 µmol EDTA equivalent/g sample ตามลำดับการศึกษาฤทธิ์คีเลชันของโลหะ (Metal Chelating Activity) ด้วยวิธี Ferrous Metal Chelating เป็นตรวจสอบหาสารสกัดที่สามารถลดการเกิดปฏิกิริยาของสารเฟอร์โรซีน (Ferrozine) กับไอออนของโลหะ (Kim et al., 2008) Ebrahimzadeh และ คณะ (2008) พบว่า สารประเภทฟลาโวนอยด์และแทนนินมีฤทธิ์ในการจับโลหะได้ดีอีกทัั้งงานวิจัยของ Mohan และ คณะ (2012) พบว่า มีีสารกลุ่มแทนนินและฟีนอลิกมีฤทธิ์ในการจับโลหะได้เช่นกัน (ดังภาพที่ 135)
ภาพที่ 136 ค่าความสามารถในการจับโลหะของชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ แถบความคลาดเคลื่อนแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=3) ค่าเฉลี่ยที่มีตัวอักษรแตกต่างกัน
บนกราฟแท่ง มีความแตกต่างกันทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญที่ระดับความเชื่อมั่นร้อยละ 95 (P≤0.05)
4). การแยกองค์ประกอบทางเคมีของใบชาเมี่ยง
ใบชาเมี่ยงแห้งปั่นละเอียด จำนวน 1 กิโลกรัม สกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอล 4 ลิตร ด้วยการแช่ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 วัน ทำการสกัดซ้ำอีก 2 ครั้ง กรองแล้วนำไประเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่องระเหยแบบสุญญากาศได้สารสกัดหยาบใบชาเมี่ยง 82.17 กรัม จากนั้นนำสารสกัดหยาบใบชาเมี่ยงแยกด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทราฟีเฟสคงที่ซิลิกาเจล (คอลัมน์ สูง 12 เซนติเมตร เส้นผ่านศูนย์กลาง 10 เซนติเมตร) เฟสเคลื่อนใช้ตัวทำละลายแบบเพิ่มขั้ว (แกรเดียน) เริ่มจาก EA: Hexane (0: 100) ถึง EA: Hexane (100:0) และ MeOH: EA (100:0) เก็บสารละลายใน
ภาชนะใบละ 50 ml ได้สาร 32 ใบ ทำการรวมแฟลกชันด้วย TLC ได้ทั้งหมด 12 แฟลกชัน ดังภาพที่ 47 จากนั้นทำการการเก็บน้ำหนักและลักษณะทางกายภาพดังตารางที่ 9
ภาพที่ 137 การแยกองค์ประกอบทางเคมีจากใบชาเมี่ยง
ตารางที่ 27 น้ำหนัก และลักษณะทางกายภาพของสาร
3.1) การแยก Fractions CS-8 และ CS-9
แฟลกชัน CS-8 และ CS-9 ทดสอบด้วย TLC โดยเฟสเคลื่อนที่ 40 % EtOAc: 2 % DCM: 58 % Hexane ภายใต้แสงยูวี 254 นาโนเมตร (ภาพที่ 48,1A) และในสารละลาย ?-anisaldehyde (ภาพที่ 48,1B) พบสารที่น่าสนใจ 2 สาร (*) ดังแสดงในภาพที่ 49
ภาพที่ 138 TLC Fractions CS-8 และ CS-9 MP (EA:DCM:Hexane (40:2:58))
ผู้วิจัยจะทำการแยกสารให้บริสุทธิ์และระบุเอกลักษณ์เทคนิคทางสเปกโทรสโกปี รวมถึง กระบวนการสกัดที่มีประสิทธิภาพต่อไป
ภาพที่ 139 การแยกสารใบชาเมี่ยง
ผู้วิจัยจะทำการแยกสารให้บริสุทธิ์และระบุเอกลักษณ์เทคนิคทางสเปกโทรสโกปี รวมถึงกระบวนการสกัดที่มีประสิทธิภาพต่อไป
3.2) การแยก Fractions CS-8
ทำการแยกด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทราฟีอีกครั้งด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทรกราฟี (คอลัมน์ สูง 16 เซนติเมตร เส้นผ่านศูนย์กลาง 6 เซนติเมตร) เฟสคงที่ที่ใช้ คือ ซิลิกาเจล เฟสเคลื่อนที่ใช้ตัวทำละลายแบบเพิ่มขั้ว (แกรเดี่ยน) ใช้โมบายเฟส 10 % EA: Hexane เพิ่มขั้วของสารละลายไปจนถึง 100 % EA: Hexane และ 100 % MeOH : EA ได้ทั้งหมด 11 แฟลกชัน จากนั้น ทำการการเก็บน้ำหนักและลักษณะทางกายภาพดังตารางที่ 28
ตารางที่ 28 น้ำหนักและลักษณะทางกายภาพของแฟรกชัน CS-8 จากใบชาเมี่ยง
นำแฟลกชัน CS8-8 ระเหยตัวทำละลาย นำเอทิล อะซิเตท กำจัดคลอโรฟิลล์ได้ตะกอนสีเหลือง ตกผลึกใหม่ด้วยเอทานอล ดังภาพที่ 50 และนำสารตัวอย่างยืนยันโครงสร้างด้วยการใช้เทคนิคนิวเคลียร์แม็กเนติกเรโซแนนซ์สเปกโทรสโกปี (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy; NMR) ดังแสดงในภาพที่140
ภาพที่ 140 สาร CS8-8
ภาพที่ 141 สเปกตรัม 1H-NMR ของสาร CS8-8
สาร CS8-8 มีสเปกตรัมที่เหมือนกับสาร CS9-3 และได้ทำการเปรียบเทียบดังแสดงในตารางที่ 11
3.3) การแยก Fractions CS-9
ทำการแยกด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทราฟีอีกครั้งด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทรกราฟี (คอลัมน์ สูง 16 เซนติเมตร เส้นผ่านศูนย์กลาง 6 เซนติเมตร) เฟสคงที่ คือ ซิลิกาเจล เฟสเคลื่อนที่ใช้ตัวทำละลายแบบเพิ่มขั้ว (แกรเดี่ยน) ใช้โมบายเฟส 10 % EA: Hexane เพิ่มขั้วของสารละลายไปจนถึง 100 % EA: Hexane และ 10% MeOH: EA ได้ทั้งหมด 8 แฟลกชัน จากนั้นทำการการเก็บน้ำหนักและลักษณะทางกายภาพดังตารางที่ 29
ตารางที่ 29 น้ำหนักและลักษณะทางกายภาพของแฟรกชัน CS-9 จากใบชาเมี่ยง
นำแฟลกชัน CS9-3 ระเหยตัวทำละลาย นำเอทิล อะซิเตท กำจัดคลอโรฟิลล์ได้ตะกอนสีเหลือง ตกผลึกใหม่ด้วยเอทานอลดังภาพที่ 141 และนำสารตัวอย่างยืนยันโครงสร้างด้วยการใช้เทคนิคนิวเคลียร์แม็กเนติกเรโซแนนซ์สเปกโทรสโกปี (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy; NMR) ดังแสดงในภาพที่ 142
ภาพที่ 142 ผลึกสาร CS9-3
ภาพที่ 143 สเปกตรัม1H และ 13C-NMR ของสาร CS9-3
จากภาพที่ 143 แสดงสเปคตรัม 1H-NMR ค่าตำแหน่งของสัญญาณ (Chemical shift, ? ) ค่าการอินทิเกรตพื้นที่ใต้พีคที่สอดคล้องกับจำนวนโปรตอนและลักษณะการแยกของพีค (Peak splitting) ของสารโดยวิเคราะห์ได้ดังนี้
ภาพที่ 144 โครงสร้างของสารอิพิคาเทชิน
เมื่อทำการผลของ 1H และ13C-NMR ของสาร CS9-3 กับงานวิจัยก่อนหน้านี้ของคุณคิมและคณะ (2009) ดังตารางที่ 30 พบว่า สารที่แยกได้ คือ สารอิพิคาเทชินจากการระบุเอกลักษณ์ด้วย 1H-NMR พบสัญญาณ ดังนี้ สัญญาณที่ตำแหน่ง dH (ppm) 4.81 (br, s, 1H, CH-2), 4.17 (br, s, 1H, CH-3), 2.86 (dd, J = 16.8, 4.6 Hz, 1H, CH-4a) และ2.74 (dd, J = 16.8, 3.0 Hz, 1H, CH-4b) ของวงแหวน tetrahydro-2H-pyran (วงแหวน C) สัญญาณที่ dH 5.92 (d, J = 2.4 Hz, 1H, CH-6) และ 5.95 (d, J = 2.4 Hz, 1H, CH-8) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน A) สัญญาณที่ dH 6.98 (d, J = 1.9 Hz, 1H, CH-2?), 6.76 (d, J = 8.1 Hz, 1H, CH-5?) และ 6.80 (dd, J = 8.2, 1.9 Hz, 1H, CH-6¢) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน B)
จากการระบุเอกลักษณ์ด้วย 13C-NMR พบสัญญาณดังนี้สัญญาณที่ตำแหน่ง dC (ppm) 79.82 (C-2), 67.44 (C-3) และ 29.22 (C-4) ของวงแหวน tetrahydro-2H-pyran (วงแหวน C) สัญญาณที่ dC 157.93 (C-5), 95.89 (C-6) 157.58 (C-7), 96.39 (C-8) 157.32 (C-9) และ 100.07 (C-10) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน A)สัญญาณที่ dC 132.24 (C-1¢), 115.29 (C-2¢) 145.87 (C-3¢), 145.71 (C-4¢) 115.89 (C-5¢) และ 119.40 (C-6¢) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน B)
เมื่อทำการผลของ 1H และ13C-NMR ของสาร CS9-3 กับงานวิจัยก่อนหน้านี้ของคุณคิมและคณะ (2009) ดังตารางที่ 30 พบว่า สารที่แยกได้ คือ สารอิพิคาเทชิน
ตารางที่ 30 การเปรียบเทียบค่าตำแหน่งของสัญญาณ (Chemical shift, d ) 1H และ13C-NMR ของสาร CS9-3 กับสารอิพิคาเทชิน
ในศึกษาการแยกองค์ประกอบทางเคมีของใบชาเมี่ยงด้วยการสกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอล แยกสารให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิคโครมาโทรกราฟีและการยืนยันโครงสร้างสารด้วยเทคนิคทางสเปกโทรสโกปี สามารถแยกสาร อิพิคาเทชิน (epicatechin) ได้น้ำหนัก 0.7293 คิดเป็นร้อยละ 0.06 % เมื่อเทียบกับใบชาเมี่ยงแห้ง โดยสารอิพิคาเทชิน จัดเป็นสารกลุ่มฟลาโวนอยด์ (flavonoids) เป็นสารพอลิฟีนอลที่มีศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระ ต้านมะเร็ง ลดความเสี่ยงการเกิดโรคหัวใจโดยลดระดับของ cholesterol และ triglyceride ในเลือด กระตุ้นระบบภูมิคุ้มกัน ลดความเสี่ยงในการเกิดโรคหัวใจ ต้านโรคอ้วนโดยกระตุ้นการสร้างความร้อนของร่างกายซึ่งช่วยเผาผลาญพลังงานและช่วยการจัดการกับโรคอ้วน ต้านโรคเบาหวานโดยสามารถลดระดับน้ำตาลในเลือดของหนูที่เป็นเบาหวาน รวมถึงมีคุณสมบัติต้านจุลินทรีย์และต้านแบคทีเรีย
ภาพที่ 145 การแยกสารสำคัญใบชาเมี่ยง
