ใบชาเมี่ยงแห้งปั่นละเอียด จำนวน 1 กิโลกรัม สกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอล 4 ลิตร ด้วยการแช่ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 วัน ทำการสกัดซ้ำอีก 3 ครั้ง กรองแล้วนำไประเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่องระเหยแบบสุญญากาศ ได้สารสกัดหยาบใบชาเมี่ยง 82.17 กรัม จากนั้น นำสารสกัดหยาบใบชาเมี่ยงแยกด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทราฟีเฟสคงที่ซิลิกาเจล (คอลัมน์ความสูง 12 เซนติเมตร เส้นผ่านศูนย์กลาง 10 เซนติเมตร) เฟสเคลื่อนใช้ตัวทำละลายแบบเพิ่มขั้ว (แกรเดี่ยน) เริ่มจาก EA: Hexane (0: 100) ถึง EA: Hexane (100:0) และ MeOH: EA (100:0) เก็บสารละลายในภาชนะใบละ 50 ml เมื่อระเหยตัวทำละลายออกและทำการรวมแฟลกชันสารด้วย TLC ได้ทั้งหมด 12 แฟลกชัน ดังแผนภาพที่ 9 ภายใต้แสงยูวี 254 นาโนเมตร (A) และ พ่นด้วยสารละลาย ?-anisaldehyde (B) จากนั้นทำการการเก็บน้ำหนักและลักษณะทางกายภาพ ดังตารางที่ 4
ภาพที่ 9 การสกัดและการแยกองค์ประกอบทางเคมีจากใบชาเมี่ยง
การแยก Fractions CS-9
ทำการแยกด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทราฟีอีกครั้งด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทรกราฟี (คอลัมน์ สูง 16 เซนติเมตร เส้นผ่านศูนย์กลาง 6 เซนติเมตร) เฟสคงที่ที่ใช้คือ ซิลิกาเจล เฟสเคลื่อนที่ใช้ตัวทำละลายแบบเพิ่มขั้ว (แกรเดี่ยน) ใช้โมบายเฟส 10%EA: Hexane เพิ่มขั้วของสารละลายไปจนถึง 100%EA: Hexane และ 10% MeOH: EA ได้ทั้งหมด 8 แฟลกชัน จากนั้นทำการการเก็บน้ำหนักและลักษณะทางกายภาพ ดังตารางที่ 5
นำแฟรกชัน CS9-3 ระเหยตัวทำละลาย นำเอทิล อะซิเตท กำจัดคลอโรฟิลได้ตะกอนสีเหลือง ตกผลึกใหม่ด้วยเอทานอล ได้สารบริสุทธิ์น้ำหนัก 0.7293 และนำผลึกที่ได้ยืนยันโครงสร้างด้วยการใช้เทคนิคนิวเคลียร์แม็กเนติกเรโซแนนซ์สเปกโทรสโกปี (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy; NMR) ได้สเปกตรัมดังแสดงในภาพที่ 10
ภาพที่ 10 สเปกตรัม 1H และ 13C-NMR ของสารอิพิคาเทชิน (isolated)
จากภาพที่ 10 แสดงสเปคตรัม 1H-NMR ค่าตำแหน่งของสัญญาณ (Chemical shift, ? ) ค่า การอินทิเกรตพื้นที่ใต้พีคที่สอดคล้องกับจำนวนโปรตอน และลักษณะการแยกของพีค (Peak splitting) ของสารสามารถอธิบายได้ดังนี้
ภาพที่ 11 โครงสร้างของสารอิพิคาเทชิน
จากการระบุเอกลักษณ์ด้วย 1H-NMR พบสัญญาณดังนี้สัญญาณที่ตำแหน่ง ?H (ppm) 4.81 (s, 1H, CH-2), 4.17 (br, s, 1H, CH-3), 2.86 (dd, J = 16.8, 4.6 Hz, 1H, CH-4a) และ 2.74 (dd, J = 16.8, 3.0 Hz, 1H, CH-4b) ของวงแหวน tetrahydro-2H-pyran (วงแหวน C) สัญญาณที่ ?H 5.92 (d, J = 2.4 Hz, 1H, CH-6) และ 5.95 (d, J = 2.4 Hz, 1H, CH-8) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน A) สัญญาณที่ ?H 6.98 (d, J = 1.9 Hz, 1H, CH-2?), 6.76 (d, J = 8.1 Hz, 1H, CH-5?) และ 6.80 (dd, J = 8.2, 1.9 Hz, 1H, CH-6?) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน B) 3จากการระบุเอกลักษณ์ด้วย 13C-NMR พบสัญญาณดังนี้สัญญาณที่ตำแหน่ง ?C (ppm) 79.82 (C-2), 67.44 (C-3) และ 29.22 (C-4) ของวงแหวน tetrahydro-2H-pyran (วงแหวน C) สัญญาณที่ ?C 157.93 (C-5), 95.89 (C-6) 157.58 (C-7), 96.39 (C-8) 157.32 (C-9) และ 100.07 (C-10) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน A)สัญญาณที่ ?C 132.24 (C-1?), 115.29 (C-2?) 145.87 (C-3?), 145.71 (C-4?) 115.89 (C-5?) และ 119.40 (C-6?) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน B) เมื่อทำการผลของ 1H และ13C-NMR ของสาร CS9-3 กับงานวิจัยก่อนหน้านี้ของคุณคิมและคณะ ดังตารางที่ 6 พบว่าสารที่แยกได้คือสารอิพิคาเทชิน แสดงโครงสร้างดังภาพที่ 11
การแยก Fractions CS-11
ทำการแยกด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทราฟีด้วยเทคนิคคอลัมน์โครมาโทรกราฟี (คอลัมน์ สูง 10 เซนติเมตร เส้นผ่านศูนย์กลาง 6 เซนติเมตร) เฟสคงที่ที่ใช้คือ ซิลิกาเจล เฟสเคลื่อนที่ใช้ตัวทำละลายแบบเพิ่มขั้ว (แกรเดี่ยน) ใช้โมบายเฟส 30%EA: Hexane ได้ทั้งหมด 4 แฟลกชัน จากนั้นทำการการเก็บน้ำหนักและลักษณะทางกายภาพ ดังตารางที่ 7
นำแฟรกชัน CS11-4* ระเหยตัวทำละลาย นำเอทิล อะซิเตท กำจัดคลอโรฟิลได้ตะกอนสีเหลือง ตกผลึกใหม่ด้วยเอทานอล ได้สารบริสุทธิ์น้ำหนัก 0.8951 และนำผลึกที่ได้ยืนยันโครงสร้างด้วยการใช้เทคนิคนิวเคลียร์แม็กเนติกเรโซแนนซ์สเปกโทรสโกปี (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy; NMR) ได้สเปกตรัม ดังแสดงในภาพที่ 12
ภาพที่ 12 สเปกตรัม 1H และ 13C-NMR ของสารสารคาเทชิน (isolated)
จากภาพที่ 12 แสดงสเปคตรัม 1H-NMR ค่าตำแหน่งของสัญญาณ (Chemical shift, ? ) ค่า การอินทิเกรตพื้นที่ใต้พีคที่สอดคล้องกับจำนวนโปรตอน และลักษณะการแยกของพีค (Peak splitting) ของสาร สามารถอธิบายได้ดังนี้
ภาพที่ 13 โครงสร้างของสารคาเทชิน
จากการระบุเอกลักษณ์ด้วย 1H-NMR พบสัญญาณดังนี้สัญญาณที่ตำแหน่ง ?H (ppm) 4.58 (d, J = 7.6 Hz, 1H, CH-2), 3.99 (td, J = 7.8, 5.4 Hz, 1H, CH-3), 2.86 (dd, J = 16.2, 5.4 Hz, CH-4a) และ 2.52 (dd, J = 16.1, 8.1 Hz, CH-4b) ของวงแหวน tetrahydro-2H-pyran (วงแหวน C) สัญญาณที่ ?H 5.94 (d, J = 2.3 Hz, 1H, CH-6) และ 5.87 (d, J = 2.4 Hz, 1H, CH-8) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน A) และ สัญญาณที่ ?H 6.85 (d, J = 1.8 Hz, 1H, CH-2?), 6.78 (d, J = 8.1 Hz, 1H, CH-5?) และ 6.73 (dd, J = 8.1, 2.0 Hz, 1H, CH-6?) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน B)
จากการระบุเอกลักษณ์ด้วย 13C-NMR พบสัญญาณดังนี้สัญญาณที่ตำแหน่ง ?C (ppm) 82.81 (C-2), 68.77 (C-3) และ 28.47 (C-4) ของวงแหวน tetrahydro-2H-pyran (วงแหวน C) สัญญาณที่ ?C 157.77 (C-5), 95.52 (C-6) 157.52 (C-7), 96.31 (C-8) 156.87 (C-9) และ 100.84 (C-10) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน A)สัญญาณที่ ?C 132.18 (C-1?), 115.25 (C-2?) 146.21 (C-3?), 146.18 (C-4?) 116.10 (C-5?) และ 120.04 (C-6?) ของวงแหวนเบนซีน (วงแหวน B)
เมื่อทำการผลของ 1H และ13C-NMR ของสาร CS11-4 กับงานวิจัยก่อนหน้านี้ของคุณคิมและคณะ ดังตารางที่ 3.X พบว่าสารที่แยกได้คือสารคาเทชิน โครงสร้างแสดงในภาพที่ 13
