4.4) การหาปริมาณองค์ประกอบหลักทางเคมีของสารสกัดจากตัวอย่างใบชาเมี่ยงโดยใช้เทคนิคโคร               

            มาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (High performance liquid chromatography, HPLC)
            งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อหาสภาวะที่เหมาะสมในการสกัดปริมาณสารสำคัญ คือ คาเฟอีน (CAF), อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และ อิพิคาเทชิน (EC) จากใบชาเมี่ยงโดยวิธีรีฟลักซ์ด้วยเครื่องไมโครเวฟ (Microwave-assisted extraction) และทำการหาสภาวะที่เหมาะสมในการสกัด คือ ชนิดของตัวทำละลาย อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลาย กำลังไฟฟ้าที่ใช้ในการสกัด (วัตต์) และ เวลาในการสกัด (นาที) จากนั้นนำสกัดที่ได้ไปวิเคราะห์หาปริมาณสารสำคัญด้วยเทคนิค HPLC
4.5) การหาสภาวะที่เหมาะสมในการสกัดสารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และ อิพิคาเทชิน (EC) จากใบชาเมี่ยงโดยกระบวนการสกัดแบบรีฟลัก (reflux) โดยใช้เครื่องไมโครเวฟ
           ในการหาสภาวะที่เหมาะสมในการสกัดสารสารคาเฟอีน (CAF), อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และ อิพิคาเทชิน (EC) ได้ทำการหาสภาวะที่เหมาะสมของตัวแปร ดังต่อไปนี้
-    ชนิดของตัวทำละลาย คือ เมทานอล (MeOH) เอทานอล (EtOH) อะซีโตน (Acetone) และ น้ำ (H2O)
-    อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลาย คือ 1:15, 1:20, 1:25, 1:30 และ 1:35 g/mL
-    กำลังไฟฟ้าที่ใช้ในการสกัด คือ 70, 210, 350, 490 และ 630 วัตต์
-    เวลาในการสกัด (นาที) คือ 10, 15, 20, 25 และ 30 นาที 
    โดยขั้นตอนในการสกัดแสดงดังภาพที่ 144
1.1) การหาสภาวะที่เหมาะสมของชนิดของตัวทำละลาย
            นำตัวอย่างใบชาเมี่ยง 5.00xx กรัม มาสกัดโดยวิธีรีฟลักโดยใช้เครื่องไมโครเวฟ (Microwave-assisted extraction) ด้วยตัวทำละลายที่แตกต่างกัน คือ เมทานอล (MeOH), เอทานอล (EtOH), อะซีโตน (Acetone) และ น้ำ (H2O) ซึ่งใช้อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลาย 1:30 (g/mL) โดยใช้กำลังไฟฟ้าในการสกัด คือ 280 วัตต์ เป็นเวลา 10 นาที ทำการกรองสารสกัดที่ได้ออกจากตัวอย่าง จากนั้นนำสารสกัดที่ได้ 2 mL มาเจือจางด้วยเอทานอลในขวดวัดปริมาตรขนาด 10 mL นำสารสกัดไปทำการกรองผ่านแผ่นเมมเบรนที่มีขนาดของรูพรุน 0.45 ไมโครเมตร ก่อนนำไปวิเคราะห์ด้วยเทคนิค HPLC แล้วนำผลการวิเคราะห์จากสารสกัดมาเทียบกับกราฟมาตรฐานเพื่อหาปริมาณสารสารคาเฟอีน อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลตและอิพิคาเทชินที่มีอยู่ในตัวอย่างใบชาเมี่ยงเพื่อหาตัวทำละลายที่เหมาะสมที่สุดในการสกัดสารดังกล่าวเพื่อใช้ในการหาสภาวะต่อไป โดยขั้นตอนการสกัดแสดงดังภาพที่144
1.2) การหาสภาวะที่เหมาะสมของอัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลาย    
            เพื่อหาสภาวะที่เหมาะสมอัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายที่ใช้ในการสกัดสารคาเฟอีน  อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และ อิพิคาเทชินในใบชาเมี่ยง โดยการสกัดจะใช้อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายที่แตกต่างกัน คือ 1:15, 1:20, 1:25, 1:30 และ 1:35 (g/mL) โดยใช้ตัวทำละลายเอทานอลทำการสกัดเป็นระยะเวลา 10 นาที และ ใช้กำลังไฟฟ้า คือ 280 วัตต์ โดยวิธีการสกัดแสดงดังภาพที่ 144                                                                                                                                                                            1.3) การหาสภาวะที่เหมาะสมของกำลังไฟฟ้าที่ใช้ในการสกัด 
            เพื่อหาสภาวะที่เหมาะสมของกำลังไฟฟ้าที่ใช้ในการสกัดสารคาเฟอีน อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และ อิพิคาเทชิน ในการสกัดจะใช้อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายเอทานอล คือ 1:25 (g/mL) โดยใช้เวลาในการสกัด คือ 10 นาที แต่ใช้กำลังไฟฟ้าในการสกัดแตกต่างกันออกไป คือ 70, 210, 350, 490 และ 630 วัตต์ โดยวิธีการสกัดแสดงดังภาพที่ 144
1.4) การหาสภาวะที่เหมาะสมของเวลาที่ใช้ในการสกัด
            เพื่อหาสภาวะที่เหมาะสมของเวลาที่ใช้ในการสกัดสารคาเฟอีน อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และ อิพิคาเทชินในใบชาเมี่ยงโดยการสกัดจะใช้อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายเอทานอล คือ 1:25 (g/mL) ใช้กำลังไฟฟ้า คือ 350 วัตต์ แต่ใช้เวลาในการสกัดแตกต่างกันออกไป คือ 10, 15, 20, 25 และ 30 นาที โดยวิธีการสกัดแสดงดังภาพที่ 145

ภาพที่ 146 แผนภาพแสดงวิธีการสกัดสารสำคัญจากตัวอย่างใบชาเมี่ยง

4.6) การวิเคราะห์หาปริมาณคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG)และอิพิคาเทชิน (EC) ในตัวอย่างใบชาเมี่ยงโดยใช้เทคนิค Reverse phase-HPLC (RP-HPLC)
             นำสารสกัดตัวอย่างใบชาเมี่ยงที่ได้จากการสกัดโดยวิธี Microwave-assisted extraction มาวิเคราะห์หาปริมาณคาเฟอีน อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และ อิพิคาเทชิน ด้วยเทคนิค RP-HPLC ด้วยสภาวะที่เหมาะสมของเครื่อง HPLC ในการวิเคราะห์สารดังกล่าวแสดงดังต่อไปนี้
เครื่องไฮฟอร์แมนซ์ลิควิดโครมาโทรกราฟี รุ่น FLEXAR™ LC Systems, PerkinElmer
HPLC condition:
    คอลัมน์                               : Brownlee Analytical C18 column (PerkinElmer) ความยาว 25 เซนติเมตร เส้นผ่านศูนย์กลาง            ภายใน 4.60 มิลลิเมตร ความหนาของลิควิดเฟส 5.0 ไมโครเมตร
    เฟสเคลื่อนที่                        : (A) 0.1% กรดฟอสฟอริกในน้ำ (B) เมทานอล (C) อะซีโตไนไตรล์
    อัตราการไหล                       : 1 มิลลิลิตร/นาที
    อุณหภูมิส่วนฉีดสาร                : 35?C
    ตัวตรวจวัด                           : Photodiode array detector (PDA) ความยาวคลื่น 280 นาโมเมตร
    ปริมาณของสารตัวอย่างที่ฉีด    : 10 ไมโครลิตร
    สภาวะของการแยก        : Gradient elution
เวลา (นาที)    % เฟสเคลื่อนที่ชนิด A     % เฟสเคลื่อนที่ชนิด B     % ของเฟสเคลื่อนที่ชนิด C
       0                       95                               0                                    5
       2                       95                               0                                    5
       7                       85                              10                                   5
      17                      70                              15                                  15
      22                      60                              20                                  20
      27                       0                                0                                 100
      35                       0                                0                                 100

           การวิเคราะห์ปริมาณคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG)และอิพิคาเทชิน (EC) ด้วยเทคนิค RP-HPLC โดยเตรียมสารมาตรฐานคาเฟอีน อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลตและอิพิคาเทชิน ที่มีความเข้มข้นในช่วง 0.50-200 ไมโครกรัมต่อกรัม สำหรับสารมาตรฐานคาเฟอีนและ 0.50-100 ไมโครกรัม ต่อ กรัม สำหรับสารมาตรฐานอิพิแกลโลคาเทชินแกลเลตและอิพิคาเทชิน จากนั้นนำไปวิเคราะห์ด้วยเทคนิค HPLC แล้วพลอตกราฟระหว่างพื้นที่ใต้พีคกับความเข้มข้นของสารมาตรฐานได้กราฟมาตรฐานเป็นเส้นตรงโดยมีค่าสัมประสิทธิ์เชิงเส้นตรงและมีสมการเชิงเส้นตรงเท่ากับ y=35690x-83000 (R² = 0.9994) สำหรับ CAF y=15109x-14908  (R² = 0.9993) สำหรับ EGCG และ y=7723.5x-1562.9 (R² = 0.9999) สำหรับ EC แสดงดังภาพที่ 146-148

ภาพที่ 147 กราฟมาตรฐานของสารมาตรฐานคาเฟอีน (CAF)

ภาพที่ 148 กราฟมาตรฐานของสารมาตรฐานอิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG)

ภาพที่ 149 กราฟมาตรฐานของสารมาตรฐานอิพิคาเทชิน (EC)

             RP-HPLC โครมาโทรแกรมที่ได้จากการวิเคราะห์สารมาตรฐานคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และ อิพิคาเทชิน (EC)และสารสกัดที่ได้จากตัวอย่างใบชาเมี่ยงแสดงในภาพที่ 149 

ภาพที่ 150 RP-HPLC โครมาโทรแกรมที่ได้จากการวิเคราะห์สารมาตรฐานคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC) (ก) และสารสกัดตัวอย่างใบชาเมี่ยง (ข)

5. ผลการวิเคราะห์ทางเคมี
5.1) ตัวทำละลายที่เหมาะสมในการสกัดสารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC) จากตัวอย่างใบชาเมี่ยง
            หาตัวทำละลายที่เหมาะสมในการสกัดสารสำคัญ 3 ชนิด คือ คาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC) จากตัวอย่างใบชาเมี่ยงโดยใช้ตัวทำละลายที่แตกต่างกันทั้งหมด 4 ชนิด คือ  เมทานอล (MeOH) เอทานอล (EtOH) อะซีโตน (Acetone) และ น้ำ (H2O) โดยผลการทดลองแสดงดังภาพที่ 150

ภาพที่ 151  อิทธิพลของตัวทำละลายชนิดต่างๆต่อปริมาณสารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC)

            จากผลการทดลองจะเห็นได้ว่าที่ตัวทำละลายเมทานอลสามารถสกัดสาร CAF, EGCG และ EC ได้มากที่สุดและตัวทำละลายอะซีโตนสกัดสารทั้ง 3 ชนิดได้น้อยที่สุด แต่ตัวทำละลายเมทานอล เอทานอล และน้ำ สามารถสกัดสารสำคัญทั้ง 3 ชนิดนี้ได้ในปริมาณที่ใกล้เคียงกันมาก ซึ่งเมทานอลเป็นตัวทำละลายที่มีความเป็นพิษมากกว่าเมื่อเทียบกับเอทานอลและน้ำ ดังนั้น ในงานวิจัยนี้จึงเลือกตัวทำละลายเอทานอลในการสกัดตัวอย่าง ใบชาเมี่ยงและใช้ในการหาสภาวะที่เหมาะสมของการสกัดต่อไป
5.2) สภาวะที่เหมาะสมของอัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายเอทานอล
            จากการสกัดหาปริมาณคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC) จากตัวอย่างใบชาเมี่ยงโดยทำการหาสภาวะที่เหมาะสมของอัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายเอทานอล คือ 1:15, 1:20, 1:25, 1:30 และ 1:35 (g/mL) จากผลการทดลอง พบว่า ปริมาณ CAF, EGCG และ EC ที่ได้อยู่ในช่วง 11.16-12.41, 2.68-3.08 และ 2.73-3.42 mg/g ตามลำดับ (ภาพที่ 151) 

ภาพที่ 152 อิทธิพลของอัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายเอทานอลในอัตราส่วนต่างๆ ต่อปริมาณสารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC)

            จากผลการทดลองจะเห็นได้ว่าที่อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายเอทานอลที่สามารถสกัดสาร CAF, EGCG และ EC ได้มากที่สุด คือ 1:25 (g/mL) มีปริมาณ CAF, EGCG และEC เท่ากับ 12.41, 3.08 และ 3.42 mg/g ตามลำดับ ดังนั้นจึงเลือกอัตราส่วนนี้เพื่อใช้ในการหาสภาวะที่เหมาะสมของกำลังไฟฟ้าที่ใช้สกัดต่อไป

5.3) สภาวะที่เหมาะสมของของกำลังไฟฟ้าที่ใช้ในการสกัด 
            จากการสกัดหาปริมาณ CAF, EGCG และ EC จากตัวอย่างใบชาเมี่ยงโดยทำการหาสภาวะที่เหมาะสมของกำลังไฟฟ้าของไมโครเวฟ คือ 70, 210, 350, 490 และ 630 วัตต์ จากผลการทดลอง พบว่า ปริมาณ CAF, EGCG และ EC ที่ได้อยู่ในช่วง 4.88-11.75,  1.24-2.67 และ 1.11-2.50 mg/g ตามลำดับ ดังภาพที่ 152

 
ภาพที่ 153 อิทธิพลของกำลังไฟฟ้าต่อปริมาณสารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC)

           จากผลการทดลองจะเห็นได้ว่าปริมาณสาร CAF, EGCG และ EC จะมีปริมาณเพิ่มมากขึ้นเมื่อเพิ่มกำลังไฟฟ้าในการสกัดจาก 70 ถึง 350 วัตต์ และ ปริมาณ CAF, EGCG และ EC จะเริ่มคงที่เมื่อใช้กำลังไฟฟ้า 350 (CAF=11.61, EGCG=2.67, EC=2.50 mg/g) ถึง 630 วัตต์ (CAF=11.75, EGCG=2.69, EC=2.49 mg/g) ดังนั้นจึงเลือกกำลังไฟฟ้า 350 วัตต์ เพื่อใช้หาสภาวะที่เหมาะสมของเวลาที่ใช้ในสกัดต่อไป
5.4) สภาวะที่เหมาะสมของเวลาที่ใช้ในการสกัด
จากการสกัดหาปริมาณ CAF, EGCG และ EC จากตัวอย่างใบชาเมี่ยงโดยทำการหาสภาวะที่เหมาะสมของเวลาที่ใช้ในการสกัด คือ 10, 15, 20, 25 และ 30 นาที จากผลการทดลอง พบว่า ปริมาณ CAF, EGCG และ EC ที่ได้อยู่ในช่วง 11.54-12.43,  2.34-2.92 และ 2.25-2.78 mg/g ตามลำดับ แสดงดังภาพที่ 153
 

ภาพที่ 154 อิทธิพลของเวลาที่ใช้ในการสกัดต่อปริมาณปริมาณสารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC)

            จากผลการทดลองจะเห็นได้ว่าเวลาที่ใช้ในการสกัดสาร CAF, EGCG และ EC ได้มากที่สุด คือ 20 นาที ซึ่งมีปริมาณ CAF, EGCG และ EC เท่ากับ 12.43, 2.92 และ 2.78 mg/g ตามลำดับ ดังนั้นเวลาที่เหมาะสมที่สุดในการสกัดสารทั้ง 3 ชนิด คือ 20 นาที
           จากการทดลองหาสภาวะการสกัดสาร CAF, EGCG และ EC จากตัวอย่างใบชาเมี่ยงโดยการสกัดแบบรีฟลักซ์ด้วยเครื่องไมโครเวฟ (Microwave-assisted extraction) พบว่า สภาวะที่เหมาะสมในการสกัดสาร CAF, EGCG และ EC ได้มากและเหมาะสมที่สุด คือ ใช้ตัวทำละลายเอทานอล อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายเอทานอล 1:25 (g/mL) กำลังไฟฟ้าที่ใช้ในการสกัด 350 วัตต์และสกัดโดยใช้เวลา 20 นาที แสดงดังตารางที่ 31
 

ตารางที่ 31  สภาวะที่เหมาะสมในการสกัดสารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC) จากตัวอย่างใบชาเมี่ยง
 

5.5) การหาปริมาณสารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC) ด้วยสภาวะที่เหมาะสมจากตัวอย่างใบชาเมี่ยง
            นำใบชาเมี่ยงตัวอย่างจากจังหวัดเชียงใหม่ ลำปาง น่านและแพร่ นำมาสกัดด้วยสภาวะที่เหมาะสม ดังตารางที่ 13  และทำการวิเคราะห์หาสารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC) ด้วยเทคนิค HPLC ให้ผลดังตารางที่ 32
ตารางที่ 32  การวิเคราะห์สารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC) จากตัวอย่างใบชาเมี่ยง

                        พบว่า ใบชาเมี่ยงจากจังหวัดเชียงใหม่ มีปริมาณ CAF, EGCG และ EC เท่ากับ 12.43, 2.92 และ 2.78 mg/g โดยสารสำคัญที่มากกว่าแหล่งอื่นโดยต่างกันอย่างไม่มีนัยสำคัญ