การเลือกพื้นที่ศึกษา
การศึกษาครั้งนี้จะดำเนินการศึกษาในพื้นที่ทั้ง 3 หมู่บ้านได้แก่ บ้านห้วยน้ำขุ่น ตําบลท่าก๊อ อําเภอแม่สรวย จังหวัดเชียงราย บ้านกอก ตำบลแม่ลาว อำเภอเชียงคำ จังหวัดพะเยา และบ้านไม้ฮุง ตำบลปางมะผ้า อำเภอปางมะผ้า จังหวัดแม่ฮ่องสอน
ภาพที่ 4 พื้นที่ศึกษา
การเก็บและรวบรวมข้อมูล
2.1 ในการศึกษาการใช้ประโยชน์และนิเวศวิทยาของชาเมี่ยงในพื้นที่ภาคเหนือ นั้นได้ทำการศึกษาทั้ง 3 หมู่บ้าน โดยคัดเลือกแปลงทำการศึกษาในหมู่บ้านละ 5 พื้นที่ แต่ละพื้นที่กำหนดทำการวางแปลงตัวอย่างขนาด 10 x 10 เมตร จำนวน 15 แปลง
2.2 ภายในแปลงตัวอย่าง ขนาด 10 x 10 เมตร ทำการวางแปลงตัวอย่างเพื่อศึกษาชนิดพรรณไม้ที่พบในแปลงตัวอย่าง ทำการบันทึกชนิดพรรณไม้ที่พบ และทำการวัดความโตระดับอกที่ 130 เซนติเมตร ความสูงทั้งหมด ทรงพุ่ม
ภาพที่ 5 การวางแปลงในพื้นที่สวนเมี่ยงขนาด 10 X 10 เมตร จำนวน 3 แปลงต่อ 1 พื้นที่
2.3 ภายในแปลง ตัวอย่างขนาด 10 x 10 เมตร เก็บข้อมูลมิติการเจริญเติบโตของต้นเมี่ยง โดยทำการบันทึกขนาดความโตที่คอราก หรือ ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางที่ระดับความสูงเพียงอก ความสูงทั้งหมด และความกว้างของทรงพุ่ม
2.4 จดบันทึกชนิดพรรณไม้และพืชอื่นที่อยู่ในแปลงตัวอย่าง
2.5 ทำการวางแปลงรูปสี่เหลี่ยมขนมเปียกปูน แต่ละด้านห่างกัน 5 เมตร เก็บตัวอย่างดินที่มุมทั้งสี่มุม และตรงกึ่งกลางแปลง น้ำหนักประมาณ 1 กิโลกรัม ทั้งในระดับดินชั้นบน (0-5 เซนติเมตร) และดินชั้นล่าง (20-25 เซนติเมตร)
2.6 ทำการวัดค่าความแข็งของดินทั้งแนวตั้งและแนวนอน
2.7 ทำการวิเคราะห์สมบัติทางกายภาพ และ ทางเคมีของดิน ในห้องปฏิบัติการทั้งธาตุอาหารหลักและธาตุอาหารรอง 2.8 ทำการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ปัจจัยดินที่เมี่ยงเจริญเติบโต และจัดกลุ่มธาตุอาหารที่มีผลต่อเมี่ยงโดยใช้วิธีวิเคราะห์แบบ PCA analysis
2.9 ใช้การสัมภาษณ์แบบไม่เป็นทางการ (Informal Interview) โดยสัมภาษณ์เจ้าของสวนเมี่ยงแต่ละแปลง
1. สารสกัดจากใบเมี่ยง
สารสกัดเอทานอลใบเมี่ยงละลายใน dimethyl sulfoxide (DMSO) เก็บไว้ที่ -4ºC
2. การทดสอบฤทธิ์ของสารสกัดใบเมี่ยงต่อการต้านเชื้อ Streptococcus mutans และ Lactobacillus spp. โดยวิธี disc diffusion (CLSI, 2009)
2.1 การเตรียมเชื้อ
เลี้ยงเชื้อบนอาหาร brain heart infusion broth (BHI) บ่มที่อุณหภูมิ 37 ºCที่มี 5 % CO2 นาน 18-24 ชั่วโมง ปรับความขุ่นให้ได้เท่ากับ McFarland no. 0.5 ด้วย 0.85 % normal saline solution (0.85 % NSS) จะมีเชื้อประมาณ 1.5 x 108 CFU/ml
2.2 การเตรียมสารสกัด
ละลายสารสกัดใน DMSO ให้มีความเข้มข้น 250 mg/mL หยดสารสกัด 10 µL ลงบนแผ่น disc ปราศจากเชื้อ ทิ้งไว้ให้แห้ง จะได้สารสกัดความเข้มข้น 2.5 mg/disc
2.3 การเตรียมเชื้อแบคทีเรียและทดสอบโดย Disc diffusion วิธีนี้ดัดแปลงจาก Arul (2011)
2.3.1 นำเชื้อจาก stock culture มาเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ Brain Heart Infusion medium สำหรับแบคทีเรีย Streptococcus mutans และอาหารเลี้ยงเชื้อ MRS agar สำหรับแบคทีเรีย Lactobacillus spp. นำเชื้อไปบ่มที่ 37 ºC ที่ 5 % CO2 เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง
2.3.2 เตรียมความเข้มข้นของสารสกัดหยาบใบเมี่ยงอบแห้งและเจือจางสารสกัดกับ DMSO ในอัตราส่วน 1:2 ปริมาตรของสารสกัดที่ใช้สำหรับ 1 disc คือ 20 ?l
2.3.3 นำเชื้อแบคทีเรียที่เพาะไว้มาปรับความขุ่นใน normal saline ให้เท่ากับ McFarland standard No. 0.5 (ภาพที่ 6)
ภาพที่ 6 ปรับความขุ่นของเชื้อด้วยน้ำเกลือความเข้มข้น 0.85 %
2.3.4 ใช้ไม้พันสำลีที่ปราศจากเชื้อ (cotton swab) จุ่มแบคทีเรียทดสอบที่ปรับความขุ่นแล้วมาเกลี่ยบนอาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็ง (Agar plate) รอให้ plate แห้ง ประมาณ 10-15 นาที (ภาพ 7)
ภาพที่ 7 สารละลายแบคทีเรีย ปริมาตร 0.1 mL เกลี่ย (spread) บนอาหารแข็ง
2.3.6 วางแผ่น disc บน อาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็ง (Agar plate) โดยวาง 5 disc ต่อ plate และมี negative control เป็น DMSO และ positive control เป็นยาปฎิชีวนะเตตระไซคลิน (tetracycline) บ่ม plate ที่อุณหภูมิ 37 ºC ที่ 5 % CO2 เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง (ภาพ 8)
ภาพ 8 วางแผ่น disc บน อาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็ง (Agar plate)
2.3.7 วัดเส้นผ่านศูนย์กลางบริเวณที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียอย่างสมบูรณ์ (complete inhibition zone)
3. การทดสอบหาค่า MIC และ MBC โดยวิธี broth microdilution (CLSI, 2009)
3.1 การเตรียมเชื้อ
เลี้ยงเชื้อบนอาหาร BHI บ่มที่อุณหภูมิ 37?C ที่มี 5 % CO2 นาน 18-24 ชั่วโมง ปรับความขุ่นให้ได้เท่ากับ McFarland no. 0.5 หลังจากนั้นนำไปเจือจางให้มีเชื้อประมาณ 1.0 x 106 CFU/ml ด้วย BHI broth
3.2 การเตรียมสารสกัด
เตรียมสารสกัดจาก stock solution ให้ได้ความเข้มข้นเป็น 10 เท่า หาความเข้มข้นสุดท้ายที่ต้องการ โดยนำสารสกัดมาละลายด้วยตัวทำละลาย DMSO สำหรับยา tetracycline ละลายด้วยน้ำกลั่นปราศจากเชื้อ
3.3 การทดสอบหาค่า MIC โดยวิธี broth microdilution (CLSI, 2009)
3.3.1 การเตรียมเชื้อ
เลี้ยงเชื้อบนอาหาร BHI บ่มที่อุณหภูมิ 37?C ที่มี 5 % CO2 นาน 18-24 ชั่วโมง ปรับความขุ่นให้ได้เท่ากับ McFarland no. 0.5 หลังจากนั้นนำไปเจือจางให้มีเชื้อประมาณ 1.0 x 106 CFU/ml ด้วย BHI broth
ภาพที่ 9 การเจริญของแบคทีเรียสาเหตุฟันผุ Streptococcus mutans ในอาหารเหลว
3.3.2 การเตรียมสารสกัด
เตรียมสารสกัดจาก stock solution ให้ได้ความเข้มข้นเป็น 10 เท่า หาความเข้มข้นสุดท้ายที่ต้องการ โดยนำสารสกัดมาละลายด้วยตัวทำละลาย DMSO (ภาพ 10) สำหรับยาปฎิชีวนะ tetracycline ละลายด้วยน้ำกลั่น ปราศจากเชื้อ
ภาพที่ 10 สารสกัดใบเมี่ยงของแต่ละความเข้มข้น
ทำการเจือจางสารสกัดแบบลำดับส่วนกับ 10 % DMSO ให้มีความเข้มข้น 1,024-0.5 µg/mL ใน microliter plate แบบ 96 หลุม ให้มีปริมาตรหลุมละ 20 µL ดูด BHI broth ใส่หลุมละ 80 µL ดูดเชื้อจากข้อ 3.1 ใส่ลงในแต่ละหลุม หลุมละ 100 µL เขย่าให้เข้ากัน บ่มที่สภาวะเดียวกัน นาน 24 ชั่วโมง
การอ่านผล
บันทึกความเข้มข้นต่ำสุดของสารสกัดที่เชื้อแบคทีเรียไม่สามารถเจริญเติบโตได้
ในการหาค่า MIC positive control จะเป็นยา tetracycline และ 1 % DMSO เป็น negative control
3.4 การทดสอบหาค่า MBC
ดูดเชื้อจากหลอดที่ใสจากการทดสอบหาค่า MIC มา 10 µL หยดลงบนอาหาร BHI นำไปบ่มที่สภาวะเดียวกัน
การอ่านผล
บันทึกความเข้มข้นต่ำสุดของสารสกัดที่แบคทีเรียไม่สามารถเจริญได้เป็นค่า MBC
4. วิธีการดำเนินงานเพื่อพัฒนาผลิตภัณฑ์ต้นแบบ: ยาสีฟันใบเมี่ยงและน้ำยาบ้วนใบเมี่ยงสู่การต่อยอดเชิงพาณิชย์
การดำเนินงานประกอบด้วยขั้นตอนต่างๆ ดังนี้
1. ประชุมร่วมระหว่างผู้วิจัยและภาคเอกชนเพื่อเตรียมการและกำหนดแนวทางการดำเนินการผลิต ยาสีฟันใบเมี่ยงและน้ำยาบ้วนปากใบเมี่ยงในเชิงพาณิชย์
2. การพัฒนาผลิตภัณฑ์ยาสีฟันใบเมี่ยงและน้ำยำบ้วนปากใบเมี่ยงเพื่อการต่อยอด
3. การเตรียมวัตถุดิบและบรรจุภัณฑ์เพื่อผลิตยาสีฟันใบเมี่ยงและน้ำยาบ้วนปากใบเมี่ยงโดยภาคเอกชน
4. การผลิตสินค้าสำเร็จรูปยาสีฟันใบเมี่ยงและน้ำยาบ้วนปากใบเมี่ยงขนาดทดลองโดยภาคเอกชน
6. การวิเคราะห์การยอมรับผลิตภัณฑ์ยาสีฟันใบเมี่ยงและน้ำยาบ้วนปากใบเมี่ยง
5. การพัฒนาสูตรตำรับผลิตภัณฑ์ยาสีฟันสมุนไพรใบเมี่ยงและน้ำยาบ้วนปากใบเมี่ยง
5.1 การเตรียมน้ำยาบ้วนปากใบเมี่ยง
5.2 การเตรียมยาสีฟันสมุนไพรใบชาเมี่ยง
ผลิตภัณฑ์ยาสีฟันที่มีจำหน่ายในท้องตลาดมี 3 ชนิด คือ ชนิดเป็นครีมขาว (toothpaste) ชนิดผง (toothpowder) และชนิดเจล (gel)
วิธีการเตรียมน้ำยาบ้วนปากใบชาเมี่ยง
1. เตรียมสารละลายของสารใบชาเมี่ยงในเอทานอล ให้มีความเข้มข้น 100 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร
2. ชั่งหรือตวงกลีเซอรีนตามปริมาณที่คำนวณได้ ใส่ลงในภาชนะ (1) ผสม พอลิซอเบท 80 โซเดียม เบน โซเอทและโซเดียม แซคคาริน ที่ชั่งไว้แล้วและผสมน้ำบริสุทธ์ ลงไป ¾ ของตำรับ
3. ชั่งน้ำมันสะระแหน่ตามปริมาตรที่กำหนดใส่ลงในภาชนะ (2)
4. คำนวณปริมาณสารสกัดตามสูตรตำรับใส่ลงในภาชนะ (2) คนผสมให้เข้ากัน
5. ค่อยๆ เทสารละลายจากภาชนะ (1) ลงภาชนะ (2) ช้าๆ คนตลอดเวลา
6. ปรับปริมาตรด้วยน้ำบริสุทธิ์จนได้ปริมาตรที่ต้องการ
วิธีการเตรียมยาสีฟันสมุนไพรใบชาเมี่ยง
1. เตรียมสารละลายของสารสกัดใบชาเมี่ยงในเอทานอล ให้มีความเข้มข้น 100 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร
2. ชั่งสารคาร์บอกซีเมทิล เซลลูโลส ตามที่คำนวณได้ บดในภาชนะ (1) ผสมกลีเซอรีนที่ชั่งไว้ลงไป
3. เติมน้ำบริสุทธิ์ ตามที่คำนวณได้ลงในภาชนะ (1) เติม ไซลิทอลและโซเดียม แซคคาริน ที่ชั่งไว้ลงไป
4. หยดน้ำมันสะระแหน่และพาราเบนลงไปในภาชนะ (1)
5. เติม แคลเซียม คาร์โบเนต ที่ชั่งไว้ลงในภาชนะ (1)
6. คำนวณปริมาณสารสกัดตามสูตรตำรับใส่ลงในภาชนะ (1) คนผสมให้เข้ากัน
7. เติม โซเดียม ลอริล ซัลเฟต ที่ชั่งไว้ ลงในภาชนะ (1) ค่อยๆ คนเบาๆ
การพัฒนาเป็นสูตรตำรับและทดสอบ ดังนี้
Specification ของยาสีฟันใบชาเมี่ยงและน้ำยาบ้วนปากใบชาเมี่ยง แสดงในตาราง 1 และตาราง 2 ประกอบด้วยลักษณะทางกายภาพและสูตร
การทดสอบคุณสมบัติทางกายภาพของผลิตภัณฑ์ ประกอบด้วย การตรวจลักษณะภายนอก เช่น สี กลิ่น และตะกอน เป็นต้น
การทดสอบคุณสมบัติทางเคมีของผลิตภัณฑ์ ประกอบด้วย การตรวจค่า pH และการตรวจ Thin layer Chromatogram ของวัตถุดิบใบชาเมี่ยงอบแห้ง
สภาวะการศึกษาความคงตัวของผลิตภัณฑ์ดูแลช่องปาก
ตำรับน้ำยาบ้วนปากและยาสีฟันใบชาเมี่ยงจะบรรจุอยู่ในภาชนะกันแสงและปิดสนิท โดยมีสภาวะการเก็บ 2 สภาวะ คือ
1) สภาวะปกติ อุณหภูมิ 30ºC
2) สภาวะเร่ง อุณหภูมิ 45ºC
การตรวจสอบคุณลักษณะทางกายภาพและเคมีของผลิตภัณฑ์ดูแลช่องปาก
1 ลักษณะภายนอกของผลิตภัณฑ์ดูแลช่องปาก
ลักษณะภายนอกของตำรับน้ำยาบ้วนปากและยาสีฟันสมุนไพรใบชาเมี่ยง ประเมินโดยการสังเกตลักษณะ สีของตำรับ ความใส เป็นต้น
2 ค่าความเป็นกรดด่างของผลิตภัณฑ์ดูแลช่องปาก
ค่าความเป็นกรดด่างของตำรับน้ำยาบ้วนปากและยาสีฟันสมุนไพรใบชาเมี่ยง ตรวจสอบด้วยเครื่องวัดความเป็นกรดด่าง (pH meter) วัดตัวอย่างละ 3 ครั้ง
3 การหาปริมาณสารสำคัญในผลิตภัณฑ์ดูแลช่องปาก
นำตำรับน้ำยาบ้วนปากและยาสีฟันสมุนไพรใบชาเมี่ยงที่เตรียมได้มาชั่งน้ำหนักที่แน่นอน ละลายใน ethanol ปั่นด้วย magnetic stirrer เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นนำสารละลายที่ได้ไปกรองผ่าน membrane ขนาด 0.45 micron เพื่อนำไปวิเคราะห์หาปริมาณคาเทชิน (Catechine) ด้วยเครื่องโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง โดยใช้ C18 column reverse phase (4.6 x 250 มิลลิเมตร, 5 ไมโครเมตร) อัตราการไหล (Flow rate) เท่ากับ 1 มิลลิลิตร/นาที, ปริมาตรที่ใช้ฉีดเท่ากับ 20 ไมโครลิตร วิเคราะห์โดยยูวี สเปกโตรสโกปี (UV Spectroscopy) ความยาวคลื่น 320 นาโนเมตร
4 การประเมินฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของผลิตภัณฑ์ดูแลช่องปาก ด้วย DPPH assay
เตรียม DPPH (MW 394.32) ความเข้มข้น 200 ไมโครโมลาร์ โดยชั่งผง DPPH 7.89 มิลลิกรัม ละลายในเอทานอลปริมาตร 100 มิลลิลิตร เตรียมสารตัวอย่าง ได้แก่ น้ำยายาบ้วนปากใบชาเมี่ยงจะนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ โดยแสดงผลเป็นค่าร้อยละการยับยั้ง ส่วนยาสีฟันสมุนไพรใบชาเมี่ยงจะเตรียมให้ได้ความเข้มข้น 1000, 800, 600, 400, 200 และ 100 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ และนำไปทดสอบสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH โดยใส่สารละลายตัวอย่าง 100 ไมโครลิตร ใน 96 well plate จากนั้นใส่สารละลาย 200 ไมโครโม ลาร์DPPH แล้วนำไป incubate อุณหภูมิ 37?C เป็นเวลา 30 นาที นำไปวัดค่าการดูดกลืนแสง (Absorbance) ที่ความยาวคลื่น 520 นาโนเมตร ด้วยเครื่อง microplate reader คำนวณหาค่า % Inhibition ตามสมการ
6. การวิเคราะห์การยอมรับผลิตภัณฑ์ยาสีฟันใบชาเมี่ยงและน้ำยาบ้วนปากใบชาเมี่ยง
สำรวจตลาดเบื้องต้นเพื่อประเมินกลุ่มเป้าหมายและเป็นแนวทางในการวางแผนการพัฒนาผลิตภัณฑ์ต่อไป วัตถุประสงค์เพื่อเพื่อทำความเข้าใจพฤติกรรมการซื้อผลิตภัณฑ์ของกลุ่มลูกค้าเป้าหมายในด้านต่างๆดังต่อไปนี้
– คุณสมบัติของผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ (Product Attributes)
– ปัจจัยที่มีผลต่อการตัดสินใจซื้อ (Factors Influencing Purchase Decision)
6.1 ยาสีฟันสมุนไพรใบชาเมี่ยง
การวิจัยเชิงปริมาณ (Quantitative concept and product test)
โดยกลุ่มตัวอย่างจะได้ใช้สินค้าจริง (In-use Test) บันทึกผลด้วยการสังเกตและสัมภาษณ์
• ขนาดกลุ่มตัวอย่าง จำนวน 30 คน
• การคัดเลือกกลุ่มตัวอย่าง: ใช้หลักการสุ่มตัวอย่างแบบเจาะจง (Purposive Sampling)
• คุณสมบัติของกลุ่มตัวอย่าง o ทุกคนจะต้องเป็นคนที่ใช้ยาสีฟันสมุนไพรเป็นประจำ อย่างน้อย 1 ครั้งต่อวันและใช้ยาสีฟันสมุนไพร ต่อเนื่องอย่างน้อย 6 เดือน ขึ้นไป
o เป็นคนตัดสินใจเลือกซื้อและเลือกใช้ยาสีฟันสมุนไพรด้วยตัวเอง
o ผู้ชายและผู้หญิง อายุ 20-60 ปี
o ไม่ปฏิเสธที่จะใช้ผลิตภัณฑ์จากสมุนไพรทุกประเภท
o ไม่ทำงานในกลุ่มอาชีพต้องห้าม ได้แก่ พนักงานฝ่ายใดๆ ก็ตามของธุรกิจยาสีฟันและน้ำยาบ้วนปาก และไม่ทำงานในสายงานการตลาด การประชาสัมพันธ์และงานวิจัยทุกประเภท
o ต้องไม่เคยเข้าร่วมกลุ่มทดสอบผลิตภัณฑ์ประเภทยาสีฟันหรือน้ำยาบ้วนปากใน 6 เดือน ที่ผ่านมา ยกเว้นงานวิจัยครั้งนี้
6.2 น้ำยาบ้วนปากใบชาเมี่ยง
การวิจัยเชิงปริมาณ (Quantitative concept and product test) โดยกลุ่มตัวอย่างจะได้ใช้สินค้าจริง (In-use Test) บันทึกผลด้วยการสังเกตและสัมภาษณ์
• ขนาดกลุ่มตัวอย่าง จำนวน 30 คน
• การคัดเลือกกลุ่มตัวอย่าง: ใช้หลักการสุ่มตัวอย่างแบบเจาะจง (Purposive Sampling)
• คุณสมบัติของกลุ่มตัวอย่าง
o ทุกคนจะต้องเป็นคนที่ใช้น้ำยาบ้วนปากเป็นประจำอย่างน้อย 1 ครั้งต่อวันและใช้น้ำยาบ้วนปากอย่าง ต่อเนื่องอย่างน้อย 6 เดือน ขึ้นไป
o เป็นคนตัดสินใจเลือกซื้อและเลือกใช้น้ำยาบ้วนปากด้วยตัวเอง
o ผู้ชายและผู้หญิง อายุ 25-65 ปี
o ไม่ปฏิเสธที่จะใช้ผลิตภัณฑ์จากสมุนไพรทุกประเภท
o ไม่ทำงานในกลุ่มอาชีพต้องห้าม ได้แก่ พนักงานฝ่ายใดๆก็ตามของธุรกิจยาสีฟันและน้ำยาบ้วนปากและไม่ทำงานในสายงานการตลาด การประชาสัมพันธ์และงานวิจัยทุกประเภท
o ต้องไม่เคยเข้าร่วมกลุ่มทดสอบผลิตภัณฑ์ประเภทยาสีฟันหรือน้ำยาบ้วนปากใน 6 เดือนที่ผ่านมา ยกเว้นงานวิจัยครั้งนี้
เครื่องมือที่ใช้ในการวิจัย
1) แบบสอบถามที่ใช้ในการทดสอบ การยอมรับแนวคิดผลิตภัณฑ์โดยมีลักษณะเป็นแบบมาตรประเมินค่า 5 ระดับ (Rating Scale) และคำถามปลายเปิด (Open-ended question)
2) แบบสอบถามที่ใช้ในการทดสอบผลิตภัณฑ์ (Product In-use Test) โดยมีลักษณะเป็นแบบมาตร ประเมินค่า 5 ระดับ (Rating Scale) และคำถามปลายเปิด (Open-ended question)
เครื่องมือแบบสอบถามที่ใช้ในการวิจัยครั้งนี้ใช้ในการวัดความพึงพอใจและพฤติกรรมในการบริโภค ผลิตภัณฑ์ยาสีฟันและน้ำยาบ้วนปากของผู้บริโภค ซึ่งแบบสอบถามที่สร้างขึ้น แบ่งออกเป็น 2 ส่วนใหญ่ๆ ประกอบด้วย
ส่วนที่ 1 เป็นคำถามด้านประชากรศาสตร์
ที่เกี่ยวข้องกับข้อมูลส่วนบุคคลของผู้ตอบแบบสอบถามโดยเป็นคำถามแบบให้เลือกตอบเพียงคำตอบเดียว ได้แก่
1. เพศ เป็นระดับการวัดข้อมูลประเภทนามบัญญัติ (Nominal Scale)
2. อายุ เป็นระดับการวัดข้อมูลประเภทเรียงลำดับ (Ordinal Scale)
3. ระดับการศึกษา เป็นระดับกำรวัดข้อมูลประเภทเรียงลำดับ (Ordinal Scale)
4. สถานภาพสมรส เป็นระดับกำรวัดข้อมูลประเภทนามบัญญัติ (Nominal Scale)
5. อาชีพ เป็นระดับกำรวัดข้อมูลประเภทนามบัญญัติ (Nominal Scale)
6. ระดับรายได้ เป็นระดับกำรวัดข้อมูลประเภทเรียงลำดับ (Ordinal Scale)
ส่วนที่ 2 เป็นคำถามเกี่ยวกับการวัดระดับในด้านต่างๆ
เช่น ความพึงพอใจ พฤติกรรมและแนวโน้ม พฤติกรรม เป็นการให้คะแนนแบบ Likert scale โดยมีสเกลอยู่ 5 ระดับ ดังนี้
ตอนนที่ 1 การศึกษาปริมาณสารประกอบฟีนอลลิกทั้งหมด ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมด และกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ
1.1 การเตรียมตัวอย่างชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ
งานวิจัยนี้ ทำการเก็บตัวอย่างชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ ครอบคลุม 4 จังหวัด ได้แก่
1. บ้านป่าเหมี้ยง ตำบลเจ้ซ้อน อำเภอเมืองปาน จังหวัดลำปาง
2. บ้านเหล่า ตำบลสบเปิง อำเภอแม่แตง จังหวัดเชียงใหม่
3. บ้านศรีนาป่าน ตำบลเวียง อำเภอเมือง จังหวัดน่าน
4. บ้านแม่ลัว ตำบลสวนเขื่อน อำเภอเมือง จังหวัดแพร่
ขนส่งมายังสาขาวิชา วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิศวกรรมและอุตสาหกรรมเกษตร มหาวิทยาลัยแม่โจ้ จากนั้นนำไปเรียงในถาดก่อนนำไปอบแห้งด้วยตู้อบลมร้อนแบบถาด (tray dryer) (Teunaks, Ts7472, Bergen, Norway) ที่อุณหภูมิ 60?C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง ก่อนนำตัวอย่างชาเมี่ยงทั้ง 4 จังหวัด มาบดให้ละเอียดด้วยเครื่องบด (BE-120, OTTO, Bangkok, Thailand) จะได้ชาเมี่ยงาผง จากนั้นนำไปเก็บในถุงโพลีเอททีลีนก่อนนำเข้าเก็บในตู้แช่แข็ง (-20 ?C) เพื่อรอการวิเคราะห์กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระต่อไป
1.2 การเตรียมสารสกัดชาเมี่ยงด้วยตัวทำละลายน้ำและเอทานอล
เตรียมสารสกัดจากชาเมี่ยงโดยดัดแปลงวิธีของ Buamard and Benjakul (2015) โดยนำชาเมี่ยง มาผสมกับตัวทำละลายน้ำและเอทานอลที่มีมีความเข้มข้น 80 % (v/v) ในอัตราส่วน 1: 10 (w/v) จากนั้นกวนเป็นเวลา 30 นาทีโดยเครื่องกวนสารละลาย magnetic stirrer (model BIG SQUID, IKA-Werke GmbH & CO.KG, Staufen, Germany) จากนั้นนำตัวอย่างทั้งสามชุดการทดลองไปทำการโฮโมจีไนส์ด้วยเครื่องโฮโมจีไนส์เซอร์ (IKA-Labortechnik homogenize, Starfeh, Germany) ที่ความเร็ว 13500 rpm เป็นเวลา 4 นาที แล้วนำส่วนผสมไปทำการปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่องเซนติฟิวส์ (SORVALL RC50, N.Y.R, Bangkok, Thailand) ที่ความเร็ว 5000 ×g เป็นเวลา 10 นาที เพื่อแยกเอาส่วนใส (supernatant) และนำส่วนใสที่ได้มากรองด้วยกระดาษกรองเบอร์ 4 Whatman No.4 (Whatman International Ltd., Maid stone, England) จากนั้นนำไประเหยตัวทำละลายเอทานอลออกด้วยเครื่องระเหยแบบหมุน (VV 2000 LIFT, Heiodolph, Germany) จะได้สารสกัดชาเมี่ยง จากนั้นบรรจุสารสกัดที่ได้ในถุงโพลีเอทีลีน และนำไปเก็บที่อุณหภูมิ -20 ?C ก่อนเพื่อรอการวิเคราะห์ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด และกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระต่อไป
ภาพที่ 11 สารสกัดชาเมี่ยงที่ทำกการเจือจางด้วยตัวทำละลายเอทานอลก่อนการวิคราะห์ปริมาสารฟีนอลลิกทั้งหมด ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมด และกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระทั้ง 4 วิธี
1.3 การวิเคราะห์ปริมาณสารฟีนอลลิกทั้งหมด ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมด และกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดชาเมี่ยงที่สกัดด้วยตัวทำลละลายน้ำและเอทานอล
1.3.1 วิเคราะห์ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (Total Phenolic content)
นำสารสกัดชาเมี่ยง (10 mg/ml) ปริมาตร 100 µl ผสมกับ Folin – Ciocalteau reagent ปริมาณ 0.75 ml ซึ่งผ่านการเจือจางด้วยน้ำ DI 10 เท่า หลังจากผสมแล้วตั้งทิ้งไว้ 5 นาที จากนั้นเติมสารละลายโซเดียมคาร์บอเนต (6 %, w/v) ปริมาตร 0.75 ml ผสมให้เข้ากัน บ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 760 nm โดยใช้เครื่อง Spectrophotometer (Confirm 800 VA, Bangkok, Thailand) โดยใช้ gallic acid เป็นสารมาตรฐาน และรายงานความเข้มข้นในหน่วย catechin equivalent/g sample (Buamard & Benjakul, 2015)
1.3.2 วิเคราะห์ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมด (Total Flavonoid content)
วิเคราะห์ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ของสารสกัดชาเมี่ยงโดยวิธี aluminum chloride colorimetry ดัดแปลงวิธีจาก Do และคณะ (2014) โดยใช้เคอร์ซิตินเป็นสารมาตรฐาน (ความเข้มข้น 12.5-100 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร)ละลายสารสกัดดัวยเมทานอล นําสารสกัดแต่ละชนิดมา 0.5 มิลลิลิตร ความเข้มข้นของสารสกัด 1 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร แล้วเติมเอทานอล 95 % ลงไป 1.5 มิลลิลิตร จากนั้นเติม 10 % aluminum chloride 0.1 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากันแล้วนําไปเติม 1 M potassium acetate 0.1 มิลลิลิตร แล้วปรับปริมาตร ด้วยน้ำกลั่นจนครบ 5 มิลลิลิตรตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาทีนําสารละลายที่ได้ไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 415 นาโนเมตร คํานวณหาปริมาณสารฟลาโวนอยด์ในสารสกัดโดยเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานของสารมาตรฐานเคอร์ซิติน ในหน่วยมิลลิกรัมสมมูลของเคอร์ซิตินต่อกรัมสารสกัด (mg of quercetin equivalent / g extract)
1.3.3 วิเคราะห์กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ DPPH• (DPPH radical scavenging activity)
นำตัวอย่างสารสกัดชาเมี่ยง (5 mg/ml) ปริมาตร 1.5 ml ผสมกับสารละลาย DPPH เข้มข้น 0.15 mmol ในเมทานอลเข้มข้น 95% ปริมาตร 1.5 ml ผสมให้เข้ากัน ตั้งทิ้งไว้อุณหภูมิห้อง 30 นาทีในที่มืด วัดค่าการดูดกลืนแสงด้วยเครื่อง Spectrophotometer ที่ความยาวคลื่น 517 nm และเตรียม Blank โดยใช้น้ำกลั่นแทนตัวอย่าง จากนั้นเตรียมกราฟมาตรฐานซึ่งถูกเตรียมโดยใช้ Trolox ในช่วงความเข้มข้น 10-60 µmol และรายงานผลในหน่วย µmol Trolox equivalent/g sample (Senphan & Benjakul, 2014)
1.3.4 วิเคราะห์กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ ABTS• (ABTS radical scavenging activity)
เตรียม Stock Solution ที่มี 7.4 mmol ของสารละลาย ABTS และ 2.6 mmol ของสารละลายโพแทสเซียมเปอร์ซัลเฟต ซึ่งสารละลายจะถูกเตรียมโดยผสมสารละลาย ABTS และสารละลายโพแทสเซียมเปอร์ซัลเฟตที่เท่ากัน และตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 12 ชั่วโมงในที่มืด จากนั้นทำการเจือจางสารละลายโดยผสมสารละลาย ABTS 1 ml ด้วย เมทานอล 50 ml เพื่อให้ได้ค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 734 nmเท่ากับ ของ 1.1 ± 0.02 โดยใช้เครื่อง Spectrophotometer นำสารสกัดชาเมี่ยง 150 µl ผสมกับ 2850 µl ของสารละลาย ABTS และตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 2 ชั่วโมงในที่มืด นำไปวัดค่าการดูดกลืนแสง ที่ 734 nm โดยใช้เครื่อง Spectrophotometer จากนั้นเตรียมกราฟมาตรฐานของ Trolox ช่วง 50 ถึง 600 µmolและรายงานผลในหน่วย µmol Trolox equivalent/g sample ตามวิธีของ Senphan and Benjakul (2014)
1.3.5 วิเคราะห์ความสามารถในการรีดิวซ์เฟอร์ริก FRAP (Ferric reducing antioxidant power; FRAP)
เตรียม Stock Solution ของอะซิเตตบัฟเฟอร์ที่มีความเข้มข้น 300 mmol (pH 3.6) โดยการเติม 10 mmol ของสารละลาย TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) ใน HCl ปริมาตร 40 mmol และ 20 mmol ของสารละลาย FeCl3 .6H2O และเตรียม working solution โดยการผสม 25 ml ของ acetate buffer 2.5 ml TPTZ solution และ 2.5 ml ของ FeCl3 .6H2O และนำไปบ่มที่ 37 ?C เป็นเวลา 30 นาที นำตัวอย่างสารสกัดชาเมี่ยง (10mg/ ml; 150 µmol) ผสมกับ 2850 µl ของสารละลาย FRAP และเก็บไว้ 30 นาทีในที่มืดตรวจสอบปริมาณของ ferrous tripyridyltriazine complex (coloured product) โดยวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 593 nm และกราฟมาตรฐานของ Trolox ช่วง 50 ถึง 600 µmol และรายงานผลในหน่วย µmol Trolox equivalent/g sample ตามวิธีของ Benzie and Strain (1996)
1.3.6 วิเคราะห์ความสามารถในการจับโลหะเฟอร์รัส (Metal Chelating activity)
นำสารสกัดตัวอย่างสาสกัดชาเมี่ยง (10 mg/ ml) ปริมาตร 4.7 ml ผสมกับ 0.1 ml ของ 2 mmol FeCl2 และ 0.2 ml ของ 5 โมลาร์ Ferrozine ตั้งทิ้งไว้ 20 นาที ที่อุณหภูมิห้อง วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 562 nm โดยใช้เครื่อง Spectrophotometer เตรียม Blank เช่นเดียวกัน โดยใช้น้ำกลั่นแทนตัวอย่าง เทียบกราฟมาตรฐานความเข้มข้น 0-50 µmol โดยมี EDTA เป็นสารมาตรฐาน และรายงานผลในหน่วย µmol EDTA equivalent/ g sampleตามวิธีของ Senphan and Benjakul (2014)
1.4.การวิเคราะห์ทางสถิติ
ทำการทดลอง 3 ซ้ำในแต่ละปัจจัยที่ศึกษาวางแผนการทดลองแบบสุ่มอย่างสมบูรณ์ (Completely Randomized Design; CRD) วิเคราะห์ความแปรปรวนของข้อมูลด้วย ANOVA เปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างปัจจัยที่ศึกษาด้วย Duncans Multiple Range Test วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้โปรแกรมสำเร็จรูปเพื่อประมวลผลทางสถิติ SPSS (SPSS 11.0 for Windows, SPSS Inc, Chicago, IL, USA) ที่ระดับความเชื่อมั่นร้อยละ 95
ตอนที่ 2 การศึกษาปริมาณสารประกอบฟีนอลลิกทั้งหมด ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมดและกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระของผลิตภัณฑ์จากชาอัญสัม
ศึกษาปริมาณสารประกอบฟีนอลลิกทั้งหมด ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมดและกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระของผลิตภัณฑ์ขากชาอัญสัม จำนวน 2 ผลิตภัณฑ์ ได้แก่ น้ำยาบ้วนปากที่มีส่วนผสมของสารคาเทชินจากใบชาเมี่ยง (ภาพที่ 2) และผลิตภัณฑ์ยาสีฟันที่มีส่วนประกอบของสารคาเทชินจากใบชาเมี่ยง (ภาพที่ 3)
ภาพที่ 12 น้ำยาบ้วนปากที่มีส่วนผสมของสารคาเทชินจากใบชาเมี่ยง
ภาพที่ 13 ผลิตภัณฑ์ยาสีฟันที่มีส่วนประกอบของสารคาเทชินจากใบชาเมี่ยง
2.1 การวิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลลิกทั้งหมด ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมดและกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระของผลิตภัณฑ์ขากชาอัญสัม
2.1 วิเคราะห์ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (Total Phenolic content)
2.2 วิเคราะห์ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมด (Total Flavonoid content)
2.3 วิเคราะห์กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ DPPH• (DPPH radical scavenging activity)
2.4 วิเคราะห์กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ ABTS• (ABTS radical scavenging activity)
2.5 วิเคราะห์ความสามารถในการรีดิวซ์เฟอร์ริก FRAP (Ferric reducing antioxidant power; FRAP)
2.6 วิเคราะห์ความสามารถในการจับโลหะเฟอร์รัส (Metal Chelating activity)
2.7 การวิเคราะห์ทางสถิติ
การวิเคราะห์ข้อมูล
3.1 ทำการคำนวณหาค่าความหนาแน่น ความเด่นด้านพื้นที่หน้าตัด และความถี่ พร้อมกับหาค่าความหนาแน่นสัมพัทธ์ ความเด่นสัมพัทธ์ และความถี่สัมพัทธ์ โดยใช้สูตรดังนี้
1. ความหนาแน่น (density, D) คือ จำนวนต้นไม้ทั้งหมดของชนิดที่กำหนดที่ปรากฏในแปลงตัวอย่างต่อหน่วยพื้นที่ที่ทำการสำรวจ
2. ความเด่น (dominance, Do) ในที่นี้จะใช้ความเด่นด้านพื้นที่หน้าตัด (basal area, BA) คือ พื้นที่หน้าตัดของลำต้นไม้ชนิดที่กำหนด ที่ได้จากการวัดที่ระดับความสูง 1.30 เมตร จากพื้นดินต่อหน่วยพื้นที่ที่ทำการสำรวจ
3. ความถี่ (frequency, F) คือ อัตราร้อยละของจำนวนแปลงตัวอย่างที่ปรากฏพันธุ์ไม้ชนิดที่กำหนดต่อจำนวนแปลงตัวอย่างทั้งหมดที่ทำการสำรวจ
4. ค่าความหนาแน่นสัมพัทธ์ของชนิดไม้ (relative density, RD) คือ สัดส่วนของความหนาแน่นของชนิดไม้ที่ต้องการต่อค่าความหนาแน่นทั้งหมดของไม้ทุกชนิดในสังคม คิดเป็นค่าร้อยละ
5. ค่าความเด่นสัมพัทธ์ของชนิดไม้ (relative dominance, RDo) คือ ค่าสัดส่วนของความเด่นของชนิดไม้ที่ต้องการต่อค่าความเด่นทั้งหมดของไม้ทุกชนิดในสังคม คิดเป็นค่าร้อยละ
6. ค่าความถี่สัมพัทธ์ของชนิดไม้ (relative frequency, RF) คือ สัดส่วนของความถี่ของชนิดไม้ที่ต้องการต่อค่าความถี่ทั้งหมดของไม้ทุกชนิดในสังคม คิดเป็นค่าร้อยละ
7. หาค่าดัชนีความสำคัญของชนิดไม้ (importance value index, IVI) คือ ผลรวมของค่าความหนาแน่นสัมพัทธ์ ความเด่นสัมพัทธ์ และความถี่สัมพัทธ์ ของชนิดไม้นั้นในสังคม ซึ่งหาได้จากสูตร
3.2 ลักษณะเชิงสังเคราะห์ของสังคม (synthetical characteristics) ทำการวิเคราะห์ข้อมูลดังต่อไปนี้
3.2.1 ดัชนีความหลากหลาย (Shannon-Wiener index of diversity) คำนวณตามวิธีการของ Krebs (1972) ดังนี้
การวิเคราะห์ข้อมูลเชิงปริมาณ โดยการวิเคราะห์ข้อมูลด้วยสถิติบรรยาย ได้แก่ ความถี่ ร้อยละ ค่าเฉลี่ย และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน การทดสอบความแตกต่างของระดับคะแนนระหว่างกลุ่มย่อย Significantly test (T-test)
เป้าหมายและตัวชี้วัด
ได้ผลการศึกษาการรับรู้และทัศนคติของกลุ่มตัวอย่างที่มีต่อแนวคิดผลิตภัณฑ์ยาสีฟันและน้ำยาบ้วนปากใบชาเมี่ยงและได้ผลการประเมินคุณภาพผลิตภัณฑ์ของยาสีฟันและน้ำยาบ้วนปากใบชาเมี่ยง
