ปริมาณสารฟีนอลิกทั้งหมดของสารสกัดชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือครอบคลุม 4  จังหวัด ได้แก่ จังหวัดแพร่ จังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่านแสดงดังภาพที่ 4 พบว่า ปริมาณสารฟีนอลิกทั้งหมดของสารสกัดชาเมี่ยงจากจังหวัดแพร่สูงกว่าจังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่าน โดยมีปริมาณของสารฟีนอลิกที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ เท่ากับ 2,492.35 2,166.42 1,965.39 และ 1,931.6 mg catechin acid equivalent/g extract ตามลำดับ และสารสกัดชาเมี่ยงมีค่าปริมาณสารฟีนอลิกที่สกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอลเท่ากับ 2,009.26 1,917.90 1,550.00 และ 1,441.36 mg catechin equivalent/g extract ตามลำดับ Abdullah และคณะ (2013) พบว่าปริมาณกรดฟีนอลิกและฟลาโวนอยด์มีความสัมพันธ์โดยตรงกับฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระ การศึกษาปริมาณฟีนอลิกทั้งหมดและ ฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระของของชาเมี่ยงพบว่า สารประกอบฟีนอลิกในของชาเมี่ยงละลายได้เอทานอล 80% และแปรผันตรงต่อฤทธิ์ทางชีวภาพ ได้แก่ ฤทธิ์ การต้านอนุมูลอิสระ สอดคล้องกับงานวิจัยของ Sánchez-Salcedo และคณะ (2015) ที่รายงานว่าใบหม่อนสกัดด้วยเอทานอลแสดงฤทธิ์ทางชีวภาพดีกว่า การสกัดในตัวทำละลายน้ำ และบิวทานอล นอกจากนนี้จากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือจังหวัดต่างๆมีปริมาณสารประกอบฟีนอลิกแตกต่างกันเนื่องจากชาเมี่ยงผ่านกระบวนการหมักที่ต่างกัน ทำให้มีองค์ประกอบทางเคมีที่แตกต่างกันไปส่งผลให้ชาแต่ละชนิดมีสีกลิ่น และรสชาติที่แตกต่างกัน ซึ่งต่างจากชาเขียวเป็นชาที่ไม่ผ่านการหมัก องค์ประกอบทางเคมีส่วนใหญ่จะคล้ายยอดใบชาสด โดยมีสารโพลิฟีนอลในกลุ่มคาเทชินอยู่ (catechins) มากที่สุด ชาอู่หลงมการหมักบางส่วน และชาดำมีการหมักอย่างสมบูรณ์การหมักทำให้ เอนไซม์พอลิฟีนอลออกซิเดส (polyphenol oxidase) เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของคาเทชิน และเกิดปฏิกิริยาพอลิเมอร์ไรเซชันเป็นสารในกลุ่มทีเอฟลาวิน (theaflavins, TFs) และทีอะรูบิจิน (thearubigins, TRs) (Graham, 1992)

ภาพที่ 60 ปริมาณสารฟีนอลิกทั้งหมดของสารสกัดชาเมี่ยงที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ (A) และเอทานอล (B) จากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ 4 จังหวัด (ลำปาง เชียงใหม่ น่าน และ แพร่) แถบความคลาดเคลื่อนแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=3) ค่าเฉลี่ยที่มีตัวอักษรแตกต่างกันบนกราฟแท่ง มีความแตกต่างกันทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญที่ระดับความเชื่อมั่นร้อยละ 95 (P≤0.05)

2.2 ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมด (Total Flavonoid content)

ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมดของสารสกัดชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือครอบคลุม 4  จังหวัด ได้แก่ จังหวัดแพร่ จังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่านแสดงดังภาพที่ 5 พบว่า ปริมาณปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมดของสารสกัดชาเมี่ยงจากจังหวัดแพร่สูงกว่าจังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่าน โดยมีปริมาณของสารฟีนอลิกที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ เท่ากับ 2,492.35 2,166.42 1,965.39 และ 1,931.6 mg mg quercetin eqi/g extract ตามลำดับ และสารสกัดชาเมี่ยงมีค่าปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมดที่สกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอลเท่ากับ 2,009.26 1,917.90 1,550.00 และ 1,441.36 mg quercetin eqi/g extract ตามลำดับ ซึ่งหลักการของ Al-flavonoid complexation reaction คือ การทำปฏิกิริยากันระหว่างอะลูมิเนียมไอออน และกลุ่ม o-dihydroxyl (3', 4'-OH) ในวงแหวน B และ o-dihydroxy ในโมเลกุลของสารประกอบฟลาโวนอยด์ซึ่งสามารถประสานกันช่วยเสริมให้จับกับอะลูมิเนียมไอออนได้ดียิ่งขึ้นเกิดผลิตภัณฑ์เป็นสารประกอบเชิงซ้อนของอะลูมิเนียมกับฟลาโวนอยด์ Abdullah และคณะ (2013) พบว่าปริมาณกรดฟีนอลิกและฟลาโวนอยด์มีความสัมพันธ์โดยตรงกับฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระ การศึกษาปริมาณฟีนอลิกทั้งหมดและ ฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระของของชาเมี่ยงพบว่า สารประกอบฟีนอลิกในของชาเมี่ยงละลายได้เอทานอล 80% และแปรผันตรงต่อฤทธิ์ทางชีวภาพ ได้แก่ ฤทธิ์ การต้านอนุมูลอิสระ ฟลาโวนอยด์เป็นสารพฤกษเคมีที่มีคุณสมบัติต่อต้านอนุมูลอิสระพบในเม็ดสีชนิดละลายในน้ำของผักผลไม้เมล็ดธัญพืช ใบไม้และเปลือกไม้ฟลาโวนอยด์มีอยู่มากมายหลายชนิด และพืชแต่ละชนิดจะมีฟลาโวนอยด์แต่ละประเภทในความเข้มข้นที่ต่างกันไป แท้จริงแล้วมีการศึกษาหลายชิ้นพบว่าฟลาโวนอยด์บางชนิดมีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระเหนือกว่าวิตามินซีหรือวิตามินอีถึง 50 เท่า และฟลาโวนอยด์ในองุ่นแดงมีความสามารถในการยับยั้งปฏิกิริยาออกซิเดชันของไขมันแอลดีแอล (LDL-fat) ซึ่งมีความสัมพันธ์กับการอุดตันของเส้นเลือดแดงและการเกิดโรคกล้ามเนื้อหัวใจขาดเลือดมากกว่าวิตามินอีถึงกว่าหนึ่งพันเท่า ในการการศึกษาทางคลินิกสารกลุ่มฟลาโวนอยด์ได้ถูกพัฒนาเป็นยารักษาโรคมะเร็งซึ่งมีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของเซลล์และชักนำการตายของเซลล์มะเร็งโดยไม่ส่งผลกระทบต่อเซลล์ปกติ และมีการออกฤทธิ์ในระดับโมเลกุลบ่งชี้ว่าการออกฤทธิ์ต้านมะเร็งของฟลาโวนอยด์ ได้แก่ การยับยั้งการแบ่งตัว เพิ่มจำนวนของเซลล์มะเร็งซึ่งเป็นผลมาจากการหยุดวงวัฏจักรของเซลล์ และชักนำการตายแบบอะพอพโตซิส โดยกลไกการออกฤทธิ์ของสารกลุ่มฟลาโวนอยด์เกี่ยวข้องกับการยับยั้งการส่งสัญญาณภายในเซลล์ และการแสดงออกของยีนส์ที่ขึ้นอยู่กับทรานสคริปชันแฟคเตอร์ NFKB รวมถึงการทำให้เกิดความเสียหายที่ระดับไมโทคอนเดรียของซึ่งส่งผลต่อสถานะเชิงพลังงานของเซลล์มะเร็ง (Rice-Evans, 2001)

ภาพที่ 61 ปริมาณสารฟลาโวนอยด์ทั้งหมดของสารสกัดชาเมี่ยงที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ (A) และเอทานอล (B) จากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ 4 จังหวัด (ลำปาง เชียงใหม่ น่าน และ แพร่) แถบความคลาดเคลื่อนแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=3) ค่าเฉลี่ยที่มีตัวอักษรแตกต่างกันบนกราฟแท่ง มีความแตกต่างกันทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญที่ระดับความเชื่อมั่นร้อยละ 95 (P≤0.05)

2.3 กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ DPPH• (DPPH radical scavenging activity) 
    ค่ากิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ DPPH•  ของชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ ครอบคลุม 4 จังหวัด ได้แก่ จังหวัดแพร่ จังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่านแสดงดังภาพที่ 6 พบว่า กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ DPPH•  ของชาเมี่ยงจากจังหวัดแพร่สูงกว่าจังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่าน โดยมีค่ากิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ DPPH•  ที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ เท่ากับ 322.16 224.29 225.00 และ 172.87 µmol Trolox equivalent/g extract ตามลำดับ และสารสกัดชาเมี่ยงมีค่ากิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ DPPH•  ที่สกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอลเท่ากับ 550.71 415.25 274.82 และ 200.35 µmol Trolox equivalent/g extract ตามลำดับ สารประกอบฟีนอลิกใชชาเมี่ยงที่มีความสามารถในการให้ไฮโดรเจนอะตอมเพื่อหยุดปฏิกิริยาออกซิเดชันของอนุมูลอิสระในขั้นต่อเนื่อง (chain reaction) ฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดชาเมี่ยงซึ่งทำ ปฏิกิริยากับ DPPH•  (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) ซึ่งเป็นแรดิคัลในตัวทำละลายเอทานอล สารละลายนี้มีสีม่วงซึ่งดูดกลืนแสงได้ดีที่ความยาวคลื่น 515-517 นาโนเมตร โดยเมื่อ DPPH• ทำปฏิกิริยากับสารที่มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ สีของสารละลายสีม่วงจะเปลี่ยนเป็นสีเหลือง โดยสามารถเปรียบเทียบกับสารต้านอนุมูลอิสระมาตรฐาน Trolox (XJ Li & Cui, 2011) นอกจากนั้นยัง พบว่า สารประกอบฟีนอลิกทั้งหมดมีความสัมพันธ์กับความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ โดยสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมดที่สูงจะมีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระมากตามไปด้วย  จากการทดลองนี้พบว่าปริมาณสารประกอบฟีนอลิกมีความสัมพันธ์กับค่าความสามารถในการจับกับอนุมูลอิสระ DPPH•  โดยถ้ามีปริมาณสารประกอบฟีนอลิกมาก จะทําให้มีความสามารถในการจับกับอนุมูลอิสระ DPPH•  ได้มากไปด้วย (Kim และคณะ 2007)

ภาพที่ 62 กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ DPPH•  ของสารสกัดชาเมี่ยงที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ (A) และเอทานอล (B) จากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ 4 จังหวัด (ลำปาง เชียงใหม่ น่าน และ แพร่) แถบความคลาดเคลื่อนแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=3) ค่าเฉลี่ยที่มีตัวอักษรแตกต่างกันบนกราฟแท่ง มีความแตกต่างกันทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญที่ระดับความเชื่อมั่นร้อยละ 95 (P≤0.05)

2.4 กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ ABTS• (ABTS radical scavenging activity)
กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ ABTS•  ของชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ ครอบคลุม 4 จังหวัด ได้แก่ จังหวัดแพร่ จังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่านแสดงดังภาพที่ 7 พบว่า กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ ABTS•  ของชาเมี่ยงจากจังหวัดแพร่สูงกว่าจังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่าน น่าน โดยมีค่ากิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ ABTS•  ที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ เท่ากับ 8,043.33 5,876.67 4,743.33 และ 3,843.33 µmol Trolox equivalent/g extract ตามลำดับ และสารสกัดชาเมี่ยงมีค่ากิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ ABTS•  ที่สกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอลเท่ากับ 5,154.67 4,141.33 4,008.00 และ 888.00 µmol Trolox equivalent/g extract ตามลำดับ อย่างไรก็ตามกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ ABTS•  ของชาเมี่ยงของจังหวัดแพร่และจังหวัดลำปางไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (P≤0.05) ซึ่งความสามารถในกำจัดอนุมูลอิสระ ABTS [2,2’-azinobis-(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid)] ใช้หลักการเหมือนกับการลดลงของอนุมูลอิสระ DPPH• แต่ในกรณี ABTS•  เป็นอนุมูลอิสระที่มีประจุเป็นบวก ในสารละลายจะมีสีเขียวเข้มและมีค่าการดูดกลืนแสงความยาวคลื่นสูงสุด 734 นาโนเมตร ในการติดตามปฏิกิริยา โดยในการลดลงของการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นดังกล่าว จะใช้เป็นตัวชี้วัดปฏิกิริยาที่เกิดขึ้น (สีเขียวของสารละลายจางลง) ในการเตรียมอนุมูลอิสระของ ABTS เพื่อใช้ทดสอบความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระจะมีขั้นตอนที่ยุ่งยากกว่าในกรณีของ DPPH นั่นคือ ต้องนำเอา ABTS ไปบ่มกับ potassium persulfate ด้วยอัตราส่วน 1:0.5 (stoichiometry ratio) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา12-16 ชั่วโมง เพื่อให้ได้อนุมูลอิสระที่เป็นประจุบวกของ ABTS•  ก่อนนำไปใช้ในการทดสอบปฏิกิริยาการต้านอนุมูลอิสระต่อไป (Aliaga & Lissi, 1998) ส่วนคาเทชิน (catechins) เป็นสารพฤกษเคมีที่มีประโยชน์ต่อสุขภาพ โดยคาเทชินมีคุณสมบัติในการต้านอนุมูลอิสระ (antioxidant capacity) ซึ่งเป็นประโยชน์สำคัญที่ผู้บริโภคจะได้รับจากการบริโภคชา สมบัติการต้านอนุมูลอิสระทำให้คาเทชินมีประโยชน์ต่อสุขภาพหลายอย่าง ได้แก่ช่วยลดความเสี่ยงในการเกิดมะเร็ง (Suganuma และคณะ 2011) ลดความเสี่ยงในการเกิดโรคหัวใจและโรคหลอดเลือด (Matsuyama และคณะ 2008) ช่วยควบคุมระดับน้ำตาลในเลือดของในโรคเบาหวาน (Kao และคณะ 2006) และช่วยลดความอ้วน (Liu และคณะ 2014) เป็นต้น อย่างไรก็ตามการบริโภคชาเพื่อให้ได้ประโยชน์ต่อสุขภาพนั้นขึ้นอยู่กับชนิดและปริมาณคาเทชิน รวมทั้งชีวปริมาณสารออกฤทธิ์หรือชีวประสิทธิผล (bioavailability) (Mukhtar and Ahmad, 2000) จากการศึกษา พบว่าการดื่มชาเขียวมีส่วนช่วยลดสภาวะ oxidative stress และเป็นการป้องกันการเกิด Erba และคณะ (2005) ออกซิเดชันในคน เนื่องจากคาเทชินในชามีความสามารถในการจับอนุมูลอิสระ (Reactive oxygen species: ROS) จำพวก superoxide radical, singlet oxygen, hydroxyl radical, peroxyl radical, nitric oxide, nitrogen dioxide และ peroxy nitrite ซึ่งจะช่วยลดการถูกทำลายในเนื้อเยื่อไขมัน โปรตีน และกรดนิวคลีอิคในเซลล์

ภาพที่ 63 กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ ABTS•  ของสารสกัดชาเมี่ยงที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ (A) และเอทานอล (B) จากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ 4 จังหวัด (ลำปาง เชียงใหม่ น่าน และ แพร่) แถบความคลาดเคลื่อนแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=3) ค่าเฉลี่ยที่มีตัวอักษรแตกต่างกันบนกราฟแท่ง มีความแตกต่างกันทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญที่ระดับความเชื่อมั่นร้อยละ 95 (P≤0.05)

2.5 ความสามารถในการรีดิวซ์เฟอร์ริก (Ferric Reducing Antioxidant Power; FRAP) 
ค่าความสามารถในการรีดิวซ์เฟอร์ริก (FRAP) ของชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ ครอบคลุม 4 จังหวัด ได้แก่ จังหวัดแพร่ จังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่านแสดงดังภาพที่ 8 ค่าความสามารถในการรีดิวซ์เฟอร์ริกของชาเมี่ยงของจังหวัดแพร่สูงกว่าจังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่าน โดยมีค่าความสามารถในการรีดิวซ์เฟอร์ริกที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ เท่ากับ 11,562.22  9,362.22 8,362.22 และ 5,006.67 µmol Trolox equivalent/g extract ตามลำดับ และสารสกัดชาเมี่ยงมีค่าความสามารถในการรีดิวซ์เฟอร์ริกที่สกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอลเท่ากับ 14,984.44 10,384.44 9,095.56 และ 5,251.11 µmol Trolox equivalent/g extract ตามลำดับ Ferric Reducing Ability Power (FRAP) Assay เป็นวิธีการวัดสมบัติการต้านออกซิเดชันโดยอาศัยหลักการวาสารต้านออกซิเดชันให้อิเล็กตรอนจึงจัดเป็นสารรีดิวซ์ (reducing agent) ดังนั้นจึงกล่าวได้ว่า Total Antioxidant Capacity (TAC) เป็นการวัดความสามารถรวมในการรีดิวซ์ โดยใช้สารประกอบเชิงซ้อนของเหล็กเฟอริ ค Fe3+ ซึ่ง TPTZ (ferric tripyridyltriazine) เป็นสารทดสอบอะตอมของเหล็กในสารนี้จะถูกรีดิวซ์โดยสารต้านออกซิเดชัน ได้สารประกอบเชิงซ้อนของเหล็ก Fe2+ และ TPTZ ซึ่งมีสีน้ำเงิน ดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 593 นาโนเมตรการวัดด้วย FRAP assayได้ FRAP value ออกมา เป็นวิธีการวัดค่าออกซิเดชันโดยทางอ้อม ว่าชาเมี่ยงมีฤทธิ์ในการยับยั้งกระบวนการอ๊อกซิเดชันโดยอาศัยการทำงานของกราฟมาตรฐานของ Trolox ในการเทียบ ถ้า Trolox อยู่สูง ฤทธิ์ต้านอนูมูลอิสระอยู่สูงเช่นกัน (Gliszczy?ska-?wig?o, 2006)

ภาพที่ 64 ความสามารถในการรีดิวซ์เฟอร์ริก (FRAP) ของสารสกัดชาเมี่ยงที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ (A) และเอทานอล (B) จากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ 4 จังหวัด (ลำปาง เชียงใหม่ น่าน และ แพร่) แถบความคลาดเคลื่อนแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=3) ค่าเฉลี่ยที่มีตัวอักษรแตกต่างกันบนกราฟแท่ง มีความแตกต่างกันทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญที่ระดับความเชื่อมั่นร้อยละ 95 (P≤0.05)

2.6 ความสามารถในการจับโลหะเฟอร์รัส (Metal chelating activity)
ค่าความสามารถในการจับโลหะเฟอร์รัสของชาเมี่ยงจากบริเวณพื้นที่ภาคเหนือ ครอบคลุม 4 จังหวัด ได้แก่ จังหวัดแพร่ จังหวัดลำปาง จังหวัดเชียงใหม่ และจังหวัดน่านแสดงดังภาพที่ 9 ค่าความสามารถในการจับโลหะเฟอร์รัสของชาเมี่ยงของจังหวัดเชียงใหม่สูงกว่าจังหวัดน่าน จังหวัดลำปาง และจังหวัดแพร่ โดยมีค่าความสามารถในการจับโลหะเฟอร์รัสที่สกัดด้วยตัวทำละลายน้ำ เท่ากับ 164.69 138.90 135.47 และ 106.35 µmol EDTA equivalent/g sample ตามลำดับ และสารสกัดชาเมี่ยงมีค่าความสามารถในการจับโลหะเฟอร์รัสที่สกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอลเท่ากับ 173.02 142.73 140.08 และ 115.18 µmol EDTA equivalent/g sample การศึกษาความสามารถในการจับโลหะ (Metal Chelating Activity) ด้วยวิธี Ferrous Metal Chelating เป็นตรวจสอบหาสารสกดัที่สามารถลดการเกิดปฏิกิริยาของสารเฟอร์โรซีน (Ferrozine) กับไอออนของ(Xican Li และคณะ 2011) Ebrahimzadeh และคณะ (2008) พบว่า สารประเภทฟลาโวนอยด์และแทนนินมีฤทธิ์ในการจับโลหะได้ดี นอกจากนี้ Mohan และคณะ (2012) รายงานว่าสารกลุ่มแทนนินและฟีนอลิกมีฤทธิ์ในการจับโลหะได้เช่นกัน