งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ในหาสภาวะที่เหมาะสมในการสกัดเพื่อให้ปริมาณสารสำคัญ คาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และ อิพิคาเทชิน (EC) ที่สูงจากใบชาเมี่ยง โดยวิธีรีฟลักซ์ด้วยเครื่องไมโครเวฟ (Microwave-assisted extraction) และทำการหาสภาวะที่เหมาะสมในการสกัด คือ ชนิดของตัวทำละลาย อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลาย กำลังไฟฟ้าที่ใช้ในการสกัด (วัตต์) และเวลาในการสกัด (นาที) จากนั้นนำสกัดที่ได้ไปวิเคราะห์หาปริมาณสารสำคัญด้วยเทคนิค HPLC
1.    การหาสภาวะที่เหมาะสมในการสกัดสารคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และ อิพิคาเทชิน (EC) จากใบชาเมี่ยง โดยกระบวนการสกัดแบบรีฟลัก (reflux) โดยใช้เครื่องไมโครเวฟ
ในการหาสภาวะที่เหมาะสมในการสกัดสารสารคาเฟอีน (CAF), อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และ อิพิคาเทชิน (EC) ได้ทำการหาสภาวะที่เหมาะสมของตัวแปรดังต่อไปนี้
   -    ชนิดของตัวทำละลาย คือ เมทานอล (MeOH) เอทานอล (EtOH) อะซีโตน (Acetone) และ น้ำ (H2O)
   -    อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลาย คือ 1:15, 1:20, 1:25, 1:30 และ 1:35 g/mL
   -    กำลังไฟฟ้าที่ใช้ในการสกัด คือ 70, 210, 350, 490 และ 630 วัตต์
   -    เวลาในการสกัด (นาที) คือ 10, 15, 20, 25 และ 30 นาที 
โดยขั้นตอนในการสกัดแสดงดังรูปที่ 1
       1.1     การหาสภาวะที่เหมาะสมของชนิดของตัวทำละลาย
นำตัวอย่างใบชาเมี่ยง 5.00xx กรัม มาสกัดโดยวิธีรีฟลักโดยใช้เครื่องไมโครเวฟ (Microwave-assisted extraction) ด้วยตัวทำละลายที่แตกต่างกัน คือ เมทานอล (MeOH), เอทานอล (EtOH), อะซีโตน (Acetone) และ น้ำ (H2O) ซึ่งใช้อัตรส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลาย 1:30 (g/mL) โดยใช้กำลังไฟฟ้าในการสกัดของ คือ 280 วัตต์ เป็นเวลา 10 นาที ทำการกรองสารสกัดที่ได้ออกจากตัวอย่าง จากนั้นนำสารสกัดที่ได้ 2 mL มาเจือจางด้วยเอทานอลในขวดวัดปริมาตรขนาด 10 mL จากนั้นนำสารสกัดไปทำการกรองผ่านแผ่นเมมเบรนที่มีขนาดของรูพรุน 0.45 ไมโครเมตร ก่อนนำไปวิเคราะห์ด้วยเทคนิค HPLC แล้วนำผลการวิเคราะห์จากสารสกัดมาเทียบกับกราฟมาตรฐานเพื่อหาปริมาณสารสารคาเฟอีน, อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และอิพิคาเทชิน ที่มีอยู่ในตัวอย่างใบชาเมี่ยง เพื่อหาตัวทำละลายที่เหมาะสมที่สุดในการสกัดสารดังกล่าวเพื่อใช้ในการหาสภาวะต่อไป โดยขั้นตอนการสกัดแสดงดังรูปที่ 1

       1.2     การหาสภาวะที่เหมาะสมของอัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลาย    
เพื่อหาสภาวะที่เหมาะสมอัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลาย ที่ใช้ในการสกัดสาร คาเฟอีน, อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และอิพิคาเทชิน ในใบชาเมี่ยง โดยการสกัดจะใช้อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายที่แตกต่างกัน คือ 1:15, 1:20, 1:25, 1:30 และ 1:35 (g/mL) โดยใช้ตัวทำละลายเอทานอล ทำการสกัดเป็นระยะเวลา 10 นาที และใช้กำลังไฟฟ้า คือ 280 วัตต์ โดยวิธีการสกัดแสดงดังรูปที่ 1
       1.3     การหาสภาวะที่เหมาะสมของกำลังไฟฟ้าที่ใช้ในการสกัด 
เพื่อหาสภาวะที่เหมาะสมของกำลังไฟฟ้าที่ใช้ในการสกัดสารคาเฟอีน, อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และอิพิคาเทชิน ในการสกัดจะใช้อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายเอทานอล คือ 1:25 (g/mL) โดยใช้เวลาในการสกัดคือ 10 นาที แต่ใช้กำลังไฟฟ้าในการสกัดแตกต่างกันออกไปคือ 70, 210, 350, 490 และ 630 วัตต์ โดยวิธีการสกัดแสดงดังรูปที่ 1
      1.4    การหาสภาวะที่เหมาะสมของเวลาที่ใช้ในการสกัด
เพื่อหาสภาวะที่เหมาะสมของเวลาที่ใช้ในการสกัดสารคาเฟอีน, อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และอิพิคาเทชิน ในใบชาเมี่ยง โดยการสกัดจะใช้อัตราส่วนตัวอย่างใบชาเมี่ยงต่อตัวทำละลายเอทานอล คือ 1:25 (g/mL) ใช้กำลังไฟฟ้า คือ 350 วัตต์ แต่ใช้เวลาที่ใช้ในการสกัดแตกต่างกันออกไปคือ 10, 15, 20, 25 และ 30 นาที โดยวิธีการสกัดแสดงดังภาพที่ 1

2. การวิเคราะห์หาปริมาณคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และ อิพิคาเทชิน (EC) ในตัวอย่างใบชาเมี่ยงโดยใช้เทคนิค Reverse phase-HPLC (RP-HPLC)
นำสารสกัดตัวอย่างใบชาเมี่ยงที่ได้จากการสกัดโดยวิธี Microwave-assisted extraction มาวิเคราะห์หาปริมาณคาเฟอีน อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และอิพิคาเทชิน ด้วยเทคนิค RP-HPLC ด้วยสภาวะที่เหมาะสมของ เครื่องไฮฟอร์แมนซ์ลิควิดโครมาโทรกราฟี รุ่น FLEXAR™ LC Systems, PerkinElmer ในการวิเคราะห์สารสำคัญ ดังแสดงในตารางที่ 1
 

       การวิเคราะห์ปริมาณ คาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC) ด้วยเทคนิค RP-HPLC โดยเตรียมสารมาตรฐาน คาเฟอีน อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และอิพิคาเทชิน พบสเปกตรัมสารที่เวลา (retention time)ที่ 16.4, 18.2 และ 18.7 นาที ตามลำดับ ที่มีความเข้มข้นในช่วง 0.50-200 ไมโครกรัมต่อกรัม สำหรับสารมาตรฐานคาเฟอีน และ 0.50-100 ไมโครกรัมต่อกรัม สำหรับสารมาตรฐานอิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต และอิพิคาเทชิน จากนั้นนำไปวิเคราะห์ด้วยเทคนิค HPLC แล้วพลอตกราฟระหว่างพื้นที่ใต้พีคกับความเข้มข้นของสารมาตรฐาน ได้กราฟมาตรฐานเป็นเส้นตรงโดยมีค่าสัมประสิทธิ์เชิงเส้นตรง และมีสมการเชิงเส้นตรงเท่ากับ y=35690x-83000 (R² = 0.9994) สำหรับ CAF y=15109x-14908 (R² = 0.9993) สำหรับ EGCG และ y=7723.5x-1562.9 (R² = 0.9999) สำหรับ EC แสดงดังในภาพที่ 2

                      RP-HPLC โครมาโทรแกรมที่ได้จากการวิเคราะห์สารมาตรฐานคาเฟอีน (CAF) อิพิแกลโลคาเทชินแกลเลต (EGCG) และอิพิคาเทชิน (EC) และสารสกัดที่ได้จากตัวอย่างใบชาเมี่ยง แสดงในภาพที่ 3